[发明专利]培养微生物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生产适合于产生作为细菌发酵产物的乙醇的微生物。

背景技术

根据细菌种类和环境条件，细菌代谢可通过各种不同机制发生。异养菌(包括所有的病原体)通过氧化有机化合物获得能量，碳水化合物(特别是葡萄糖)、脂质和蛋白质是最常见的被氧化的化合物。利用细菌对这些有机化合物进行的生物氧化最终会合成作为化学能来源的ATP。该过程也会生成细菌细胞进行生物合成反应所需的更加简单的有机化合物(前体分子)。细菌代谢适合底物的一般过程是糖酵解，糖酵解是一系列将葡萄糖转化为丙酮酸同时生成ATP的反应。生成代谢能的过程中丙酮酸的去向会根据微生物和环境条件而变化。主要的丙酮酸反应有三种。

第一，在需氧条件下，许多微生物会在丙酮酸脱氢酶(PDH)的催化下利用柠檬酸循环和将丙酮酸转化为乙酰辅酶A来产生能量。

第二，在厌氧条件下，某些产乙醇生物可通过在丙酮酸脱羧酶(PDC)的催化下将丙酮酸脱羧成为乙醛，并且随后在醇脱氢酶(ADH)的催化下利用NADH将乙醛还原为乙醇来进行乙醇发酵。

第三个过程是通过乳酸脱氢酶(LDH)催化，将丙酮酸转化为乳酸。

人们对使用微生物——使用天然进行厌氧发酵的微生物或使用引入了乙醇生产中所涉及基因的重组微生物——来生产乙醇很感兴趣。尽管在利用这些微生物生产乙醇方面获得了一定的成功，但是通常乙醇浓度增加会使发酵受损，特别是当微生物的乙醇耐受性水平较低时。

已经有人提出使用嗜热细菌进行乙醇生产，使用嗜热细菌的优势在于可以在较高温度下进行发酵，这使得可以在50℃以上的温度下将所产生的乙醇以蒸气的形式移出；这也使得可以利用高糖浓度进行发酵。然而，问题在于能否找到可以有效生产乙醇的合适嗜热细菌。

WO01/49865公开了一种被转化了编码丙酮酸脱羧酶的异源基因、并且具有天然的醇脱氢酶功能的革兰氏阳性细菌用于乙醇生产。所述细菌为嗜热性的杆菌(Bacillus)，可通过插入转座子使乳酸脱氢酶基因失活来对该细菌进行修饰。WO01/49865中公开的细菌全部来源于杆菌属菌株LLD-R，它是一种自发地从培养物中长出的孢子形成缺陷菌株，且在该菌株中ldh基因已经通过自发突变或化学诱变失活。所公开的菌株LN和TN是LLD-R菌株的改良过的衍生菌株。然而，全部的菌株都含有Hae III型限制性系统，所述限制性系统妨碍质粒转化并因此阻止非甲基化DNA中的转化。

WO01/85966公开了通过体内甲基化以克服限制性问题而制备的微生物。这需要将Hae III甲基转移酶从埃及嗜血杆菌(Haemophilusaegyptius)转化到LLD-R、LN和TN菌株中。然而，LLD-R、LN和TN菌株是不稳定的突变体并且会自发地回复为产乳酸的野生型菌株，特别是在低pH和高糖浓度的环境中。这会导致发酵产物从乙醇变为乳酸，使得所述菌株不适合用于乙醇生产。

WO02/29030公开了LLD-R菌株及其衍生菌株在ldh基因编码区包括一个天然存在的插入元件(IE)。将该插入元件转入(和转出)ldh基因的转座以及随后的基因失活都是不稳定的，从而导致回复。对此给出的解决方案是将质粒DNA整合到所述IE序列中。

因此，在本领域中，用于乙醇生产的微生物的产生依赖于对实验室产生的化学诱变过的杆菌属微生物进行修饰、用体内甲基化方法处理这些微生物和进一步修饰所述微生物以便将质粒DNA整合到所述IE序列中。该方法复杂并且不确定，且也存在如何使用所述菌株的管理问题。

因此需要改良过的用于乙醇生产的微生物。

发明内容

根据本发明的第一方面，一种用于生产适合于乙醇生产的嗜热微生物的方法，包括：

(i)在需氧或厌氧条件下、在适合的培养基中培养嗜热微生物；和

(ii)将用量逐渐增加的乙醇掺入所述培养基以诱导乙醇耐受性。

具体实施方式

本发明是基于处理嗜热微生物以使所述微生物对乙醇更加耐受，并因此可以更好地生产乙醇。增加所述微生物的乙醇耐受性使得所述微生物可以在其发酵过程中对所产生的乙醇更加耐受。这使得可对发酵进行改良。