[发明专利]生产重组蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生产重组蛋白的方法，更具体地涉及通过使用曲霉作为宿主生产重组蛋白的方法。

背景技术

长期以来，在生产发酵食品和饮料中，就使用日本酒曲作为酶源。当将日本酒曲用于生产发酵食品和饮料时，一般使用固体曲，其通过将曲霉培养在谷物等的表面上获得。固体曲通过传统生产方法获得。然而，所述方法是一种特殊的培养方法，即固体培养，因此不适合于大规模生产。

另一个方面，液体曲可以容易地控制培养物，所述液体曲是通过液体培养曲霉获得的曲霉的培养产物，并且是一种进行有效生产的适合的培养方法。

然而，已经公知的是，液体曲霉不能提供生产发酵食品和饮料所需的足够的酶活性，因此，很少有将液体曲用于实际生产的实例(见，非专利文献1-4)。

曲霉容易增殖，因此可以以低成本制备培养基，并且不需要特殊的培养器具，因此培养成本很低。已经在很长的时间，将曲霉用于生产发酵食品和饮料，因此其被认为是安全的宿主。因此，已经一般性尝试使用曲霉作为宿主插入来自曲霉或其他生物的基因从而强表达所述基因，以生产来自所述基因的产物，即重组蛋白(见非专利文献5)。

还已经报道了通过用麦麸进行固体培养以高产量生产重组蛋白的成功实例(见非专利文献6)。然而，所述生产以特殊的培养方式，即固体培养进行，因此不适合大规模生产。

另一方面，认为液体培养物本身在如上所述的细胞外部提供极少的蛋白，并且因此不适合于大量生产重组蛋白。

非专利文献1：Hata Y.等：J.Ferment.Bioeng(发酵生物工程杂志).，84，532-537(1997)

非专利文献2：Hata Y.等：Gene(基因)，207，127-134(1998)

非专利文献3：Ishida H.等：J.Ferment.Bioeng(发酵生物工程杂志).，86，301-307(1998)

非专利文献4：Ishida H.等：Curr.Genet(当代基因).，37，373-379(2000)

非专利文献5：R.J.Gouka，等，Appl.Microbiol.Biotechnol.(应用微生物生物技术)，47，1-11(1997)

非专利文献6：K.Tsuchiya，等，Biosci.Biotech.Biochem.(生物科学生物技术生物化学)，58，895-899(1994)

发明公开内容

本发明待解决的问题

本发明的一个目的是提供通过使用曲霉作为宿主，用液体培养方法，大量生产重组蛋白的方法，其常规上被认为不适合于生产重组蛋白，因为上述原因。

解决问题的方式

本发明的发明人已经提出了生产具有足够的酶活性的液体曲的方法(见，日本专利申请号.2004-350661，2004-352320，2004-352324，2004-378453和2005-290648，和JP-A-2003-265165)。那些方法使用这样的原料作为培养基，所述原料的表面被完全或部分用至少外壳(husk)所覆盖从而阻止营养物从原料释放到培养系统中，并且由此获得需要的酶活性，特别是淀粉分解酶，纤维素分解酶和蛋白水解酶的活性。根据所述方法，其获得的酶活性高于通过使用脱壳大麦或脱壳水稻作为原料的液体培养物获得的那些酶活性，所述脱壳大麦或脱壳水稻是烧酒(shochu)的原料。曲霉的实例包括白曲霉，黑曲霉，黄曲霉和红曲霉。

据认为，上述生产液体曲的方法增加了编码酶的基因的转录水平，并且由此生产来自那些基因的产物(即，目的酶)并且将其分泌到曲霉的细胞外部，所述酶受到由于营养物如糖和氨基酸浓度的分解代谢物阻抑的影响。

将编码目的蛋白质的基因连接到编码酶的基因的启动子下游，由此产生在其中结合连接产物的重组曲霉，根据上述生产液体曲的方法培养重组曲霉，并且因此以高产量生产目的重组蛋白，所述酶受到由于营养物如糖和氨基酸的浓度的分解代谢物阻抑的影响。

在生产重组蛋白中的另外的重要的因素是翻译的重组蛋白被适当地运输到宿主的细胞外部。甚至即使仅仅是转录水平被增加，翻译的重组蛋白通常可以积累在细胞内，或由宿主固有分泌的酶所分解。此外，除非重组蛋白在其转运到宿主的细胞外部的过程中进行了需要的修饰，否则不能生产被正确折叠的并且具有与天然蛋白的活性等价的活性的蛋白。