[发明专利]特异性改进的转谷氨酰胺酶变异体

说明书

本明领域

本发明涉及来自茂原链霉菌(Streptomyces mobaraense)的转谷氨酰胺酶新的变异体。这种变异体可用于修饰肽以改进选择性。

发明背景

通过将基团与肽缀合，适当改变性质，从而改变所述蛋白质的性质和特征是众所周知的。特别是对于治疗肽，可能需要或者甚至是必需将基团与所述肽缀合，延长肽的半寿期。这种缀合基团通常是聚乙二醇(PEG)或脂肪酸-参见J.Biol.Chem.271，21969-21977(1996)。

以前曾经用转谷氨酰胺酶(TGase)改变肽的性质。在食品工业中，特别是在乳品工业中有应用许多技术，例如使用转谷氨酰胺酶使肽交联。其它文献公开了转谷氨酰胺酶改变生理活性肽性质的用途。EP950665、EP 785276和Sato，Adv.Drug Delivery Rev.54，487-504(2002)公开了在转谷氨酰胺酶存在下，包含至少一个Gln的肽与胺官能化PEG或类似配体之间的直接反应，Wada(Biotech.Lett.23，1367-1372(2001))公开了β-乳球蛋白与脂肪酸通过转谷氨酰胺酶的直接缀合。国际专利申请WO2005070468公开了转谷氨酰胺酶可用来将官能团掺入到含有谷氨酰胺的肽中形成官能化肽，这种官能化肽在随后的步骤中，可与例如能够与所述官能化蛋白反应的聚乙二醇进行反应，形成聚乙二醇化肽(PEGylated peptide)。

转谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)亦称蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷氨酰转移酶，催化以下通用反应：

其中Q-C(O)-NH₂可表示含有谷氨酰胺的肽，Q’-NH₂则表示在上述反应中提供掺入肽的官能团的胺供体。

体内常见的胺供体是与肽结合的赖氨酸，上述反应则提供交联的肽。凝血因子-因子XIII是在受伤时实现血液凝结的转谷氨酰胺酶。不同的转谷氨酰胺酶间彼此也存在差别，例如在Gln周围的氨基酸残基需要蛋白质作为底物，也就是说不同的转谷氨酰胺酶将有不同的含有Gln的肽作为底物，这取决于与Gln残基相邻的氨基酸残基。如果将被修饰的肽含有一个以上的Gln残基，则可以利用这一方面。如果需要选择性地将肽仅在某些Gln残基上缀合，则表示可以选择出仅接受相关Gln残基作为底物的转谷氨酰胺酶来获得这种选择性。

人生长激素(hGH)含有11个谷氨酰胺残基，因此，任何转谷氨酰胺酶介导的hGH缀合都可能因选择性低而受到妨碍。已经发现在某些反应条件下，上述两步缀合反应，在茂原链霉菌转谷氨酰胺酶介导的反应中使hGH官能化，可以在两个位置，即40-Gln和141-Gln上产生官能化hGH。因此，需要鉴定能介导特异性较高的hGH官能化的转谷氨酰胺酶变异体。

发明概述

本发明的发明人预料不到地发现，在得自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶上，某些氨基酸残基的取代提供介导特异性较高的官能化hGH的转谷氨酰胺酶。

在一个实施方案中，本发明涉及得自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶(SEQ ID No.1)，其中多至3个酸性或碱性氨基酸残基被其它碱性或酸性氨基酸残基取代。

在一个实施方案中，本发明涉及分离肽，该分离肽包含与得自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶氨基酸序列有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-62、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Val-252、Asn-253、Phe-254、His-277、Tyr-278、Leu-285、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。

在一个实施方案中，本发明涉及得自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶(SEQ ID No.1)，其中所述序列在一个或多个选自以下的氨基酸残基上被修饰：Asp-4、Val-30、Tyr-75、Arg-89、Glu-115、Ser-210、Asp-221、Ala-226、Pro-227、Gly-250、Tyr-302、Asp-304和Lys-327。

在一个实施方案中，本发明涉及SEQ ID No.1中所限定的肽，该肽包含一种或多种以下的取代：Tyr-75→酸性氨基酸残基；Tyr-302→碱性氨基酸残基；和Asp-304→碱性氨基酸残基。