[发明专利]甘醇化和糖基化的禽类来源的治疗性蛋白

说明书

相关申请信息

本申请要求2005年10月21日提交的美国临时专利申请第60/729,429号 的优先权，该申请的内容以参见方式引入本说明书中。

发明背景

强烈地需要开发能使患者和医疗保健提供者降低蛋白治疗剂成本的蛋白 递送技术。一种解决办法是开发延长蛋白治疗剂体内循环半衰期的方法。该方 法也满足了患者“用户友好型”蛋白治疗剂的需要和希望，例如，不需要频繁 给药(例如注射)的蛋白治疗剂。

已证明用甘醇聚合物如聚乙二醇(PEG)共价修饰蛋白质是延长蛋白体内循 环半衰期的有效方法(Abuchowski等，1984；Hershfield，1987；Meyers等，1991)。 甘醇聚合物与蛋白质的共价结合增加了蛋白质的有效大小并降低其体内清除 速率。可购得各种大小(即分子量)的甘醇聚合物如PEG，通过使用不同大小的 甘醇聚合物可根据各种适应症来调节甘醇聚合物修饰蛋白的循环半衰期。已经 报道过的甘醇聚合物修饰(例如PEG修饰)的其它体内优点在于，提高蛋白溶解 性、提高蛋白稳定性(可能是因为保护蛋白免于蛋白酶的作用)，且降低蛋白免 疫原性。例如参见Katre等，1987；Katre，1990。此外，糖基化也能提高蛋白 治疗剂的有效性，例如通过增加蛋白质的有效大小并降低其免疫原性和体内清 除速率。

发明概述

发现鸟禽类中产生的治疗性蛋白的甘醇酸化(例如，PEG化)与糖基化的组 合具有协同作用，蛋白效力显著提高，超过仅用糖基化治疗性蛋白或仅用甘醇 酸化治疗性蛋白的效果。鸟禽类系统中产生的治疗性蛋白可糖基化，而不需要 像例如使用原核系统(例如大肠杆菌)产生治疗性蛋白时需要的那样进行体外糖 基化。

在一个有用的方面，本发明提供了组合物，该组合物包含来自转基因鸟禽 类(例如转基因鸡)的糖基化的治疗性氨基酸序列，所述治疗性氨基酸序列是与 甘醇聚合物结合的糖蛋白。例如，糖蛋白可通过化学作用(例如，离子键或氢键) 与甘醇聚合物结合。在一个尤其有用的实施方式中，糖蛋白与甘醇聚合物共价 结合。在本发明一个尤其有用的实施方式中，治疗性氨基酸序列是外源性氨基 酸序列。例如，治疗性氨基酸序列可以是人内源性氨基酸序列。

在一个有用的实施方式中，治疗性氨基酸序列是细胞因子。例如，治疗性 氨基酸序列可以是粒细胞集落刺激因子、干扰素α、干扰素β、红细胞生成素 或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。一方面，细胞因子是人内源性细胞因子。

在本发明的一方面，由转基因鸟禽类输卵管细胞提供糖基化作用。例如， 输卵管细胞可以是管状腺细胞。

在一个实施方式中，本发明提供了在鸟禽类基因表达系统中通过连接键连 接蛋白的糖基化作用。例如，治疗性氨基酸序列可以O-糖基化和/或治疗性氨 基酸序列可以N-糖基化。

本发明考虑了任何有用的甘醇聚合物与禽类来源的糖基化治疗性蛋白的 连接应用。例如，甘醇聚合物可以是聚烷撑二醇，例如聚乙二醇和聚丙二醇。 本发明并不限于任何特定分子量的甘醇聚合物。例如，甘醇聚合物的分子量可 以为约200-400,000，例如约200-20,000。

本发明考虑了甘醇聚合物通过本领域已知的任何有用的化学键合方法与 糖基化蛋白的连接。在一个实施方式中，甘醇聚合物共价结合于治疗性氨基酸 序列的氨基基团。在另一个实施例中，甘醇聚合物共价结合于治疗性氨基酸序 列的羧基基团。

在一个有用的实施方式中，来自转基因鸟禽类的糖基化治疗性氨基酸序列 是糖蛋白，包括甘醇聚合物与治疗性氨基酸序列糖基化部分的共价结合。本发 明考虑了甘醇聚合物与治疗性氨基酸序列糖基化部分任意成分的连接。例如但 不限于，本发明考虑了甘醇聚合物与n-乙酰半乳糖胺、n-乙酰葡糖胺、半乳糖 和/或n-乙酰神经氨酸或糖基化部分上存在的任何其它糖结构的连接。

在一个实施方式中，本发明产生的治疗性蛋白可溶于水相或基本上可溶于 水相中。与未甘醇酸化的相同糖基化治疗剂相比，本发明产生的治疗性蛋白无 免疫原性或免疫原性降低。

定义与缩写

本说明书提出一些定义，用于阐述和明确描述本发明所用的各种术语的含 义和范围。

术语“活性成分”和“本发明化合物”指本发明禽类来源的甘醇酸化-糖基 化蛋白治疗剂。