[发明专利]用于细胞植入的方法

说明书

发明领域

本发明涉及将活细胞植入活哺乳动物的组织缺损以促进组织缺 损的修复。

发明背景

使用细胞移植进行的组织工程方法是已知的，例如可包括例如开 放性关节手术(例如，开放性膝盖手术)和在关节手术的情况下，使 患者经历长期相对残疾的状态以恢复健康来获得最佳结果。此类方法 花费昂贵并且需要多种医疗方法例如康复和物理治疗。

使用不同形式的支架技术的方法(其中将支架(具有或不具有在 支架中培养的细胞)插入缺损)在进行只由关节镜检查指导的细胞植 入操作中遇到了困难。

关节镜自体细胞植入(Arthroscopic Autologous Cell Implantation)(称为使用小型手术干预的AACI或ACI)是治疗软骨 或骨缺损的手术操作，其中在将支架插入缺损的同时，通过使用针例 如“钝圆的”针或导管将细胞悬浮液或细胞混合物与前体固定剂施入 所述缺损。通过关节镜显现和指导该植入操作。

WO 2004/110512公开了用于在哺乳动物中治疗软骨或骨缺损的 内窥镜法，其包括鉴定缺损的位置和将软骨细胞、成软骨细胞、骨细 胞和成骨细胞施入软骨或骨的缺损。将细胞和可固化的支持材料例如 可溶性凝血酶和血纤蛋白原或胶原混合物一起使用。可设想，对于凸 关节或凹关节中的手术，可将多孔膜置于缺损的位置，但在血纤蛋白/ 细胞混合物在原位凝固后取出。WO 2004/110512中描述的方法使得能 够通过关节镜修复组织，即无需开放性关节手术(例如，开放性膝盖 手术)。

然而，WO 2004/110512中描述的方法不提供，特别是在患者在充 分修复/再生已发生之前使手术部位受压力过度的情况下，不提供完全 的或十分强健的缺损修复。

支架是其中可整合细胞的多孔结构。它们通常由生物相容性、可 生物降解的材料制成并且被加到组织中以在形成功能组织的过程中指 导细胞的组织、生长和分化。使用的材料可以是天然的或合成的来源。

之前提交的丹麦优先权申请PA200600337(以Coloplast的名义) 提供了用于本发明的部分的方法和试剂盒的优选支架材料。支架材料 和用于产生支架材料的方法不是本发明的部分。

本发明提供了用于通过细胞移植进行组织工程的方法，其包括将 固体支架整合入缺损位置，和相伴地使用细胞和固定剂前体(例如WO 2004/110512中公开的‘可固化的支持’材料)。

固定剂前体至固定剂的转化导致细胞至支架和支架至缺损部位 的有效附着。我们已令人吃惊地发现本发明的方法提供了相当高的组 织愈合率和达到可与周围未被破坏的组织相似的程度的恢复。支架的 作用不仅增加细胞迁移(例如，成软骨效应)和成活力，而且还对细胞 提供强支持，从而使得能够产生结构上强壮的组织，还使得工程改造 的组织或置换的组织对周围组织的更均匀整合。

附图概述

图1.组织学，对10μm冷冻切片的(A)甲苯胺蓝染色。10μm 冷冻切片的(B)番红O染色。

图2.免疫组织化学，观察到为棕色至黑色斑点的(A)II型胶原。 观察到的为棕色至黑色斑点的(B)聚集蛋白聚糖。

图3.基因表达。SOX9和II型胶原蛋白在水凝胶-PolyGraft系 统中显示增加的表达，当将hAC用于我们的水凝胶(SCAS原理)(具 有软骨细胞例如具有本发明中包括的其他类型的支架的血纤蛋白原/ 凝血酶组合物)时，我们也观察到了该现象。

图4.将支架置于12孔NUNC盘的底部；以一式三份重复向标记 #5和#18的行中的支架加入细胞/血纤蛋白。最后两个(2)一式三份重 复设置只包含磷酸缓冲盐溶液。

图5.将软骨细胞/水凝胶用于软骨缺损的底部。

图6.现已将MPEG-PLGA置入支架。

图7.目视ICRS评分。与三个其他的组相比，SCAS系统(直方图 上的PLGA)评分显著更高。

图8.当不处理缺损时或用微骨折处理它们时修复组织的代表性 组织学形态。如所显示的，观察到非常少的修复组织。番红O染色和 甲苯胺蓝染色。

图9.当用FIB50或用SCAS系统处理缺损时，修复组织的代表性 组织学形态。如所显示的，对于SCAS系统观察到高度的填充。(SCAS 原理)。使用番红O染色和甲苯胺蓝染色。