[发明专利]获取祖细胞系的方法

说明书

采用2005年9月2日提交的申请系列号为US60/713992的美国临时 申请作为参考。

前述申请，以及本申请和前述申请在包括前述申请进行期间中所引 用或参考的每份文件，和在前述申请、文件以及该申请和文件中所引用 的任何文件中所引用或提及的任何产品的操作指南或目录，都通过参考 的方式结合在本文中。此外，在本文中所引用的任何文件，和在本文的 引用文件中所引用或参考的所有文件，以及本文或结合到本文中的任何 产品的所有操作指南或目录，都通过参考的方式结合在本文中。通过参 考方式结合到本文中的文件或任何教导在此都可以用在本发明的实践 中。通过参考方式结合到本文中的文件不是承认的现有技术。

技术领域

本发明涉及研发、细胞生物学、分子生物学以及基因工程领域。更 特别地，本发明涉及用胚胎干细胞获取祖细胞的方法。

背景技术

干细胞与分化细胞不同，其具有分裂并自我更新或分化成具有不同 表现型和功能的子代细胞的能力(Keller，Genes Dev.2005；19：1129-1155； Wobus and Boheler，Physiol Rev.2005；85：635-678；Wiles，Methods in Enzymology.1993；225：900-918；Choi et al，Methods Mol Med.2005；105：359-368)。

鼠胚胎干细胞(ESCs)的亚全能性及其分化成来自所有3个胚层细 胞的能力使得胚胎干细胞成为用于再生性治疗多种疾病和组织损伤的理 想细胞来源(Keller，Genes Dev.2005；19：1129-1155；Wobus and Boheler， Physiol Rev.2005；85：635-678)。然而，胚胎干细胞的这种特殊性质也形成 了独特的挑战，即需要足量并同质性地产生用于治疗特定疾病或组织损 伤的合适细胞类型以保证治疗效果，并抑制生成对组织修复和再生产生 有害作用的其它细胞类型。目前，既可以强化胚胎干细胞向特定细胞系 分化和/或富集特定组织细胞类型的方法过于低效并且一般会产生导致 肿瘤发生的异质细胞群体(Keller，Genes Dev.2005；19：1129-1155；Wobus and Boheler，Physiol Rev.2005；85：635-678)。

本发明寻求解决现有技术的方法中所存在的这种以及其它问题。

发明内容

根据本发明的第一方面，我们提供了一种方法，其包括：(a)提供 胚胎干细胞(ES)；和(b)用胚胎干细胞构建祖细胞系；其中基于祖细 胞系的自我更新能力来对其进行选择。

优选地，该方法基于体细胞无法自我更新而选择排除体细胞。

在一个优选实施方式中，在没有共培养物的情况下，优选在没有细 胞饲养层的情况下获得并构建祖细胞系，其优选选择排除胚胎干细胞。

在一个优选实施方式中，祖细胞系被构建且不经转化。优选地，祖 细胞系通过把胚胎干细胞及其子代细胞暴露在促进假定祖细胞进行自我 更新的条件中而得以构建。优选地，促进自我更新的条件阻碍胚胎干细 胞的增殖。

优选地，促进自我更新的条件包括在丰富的培养基中进行培养。更 优选地，促进自我更新的条件包括在不含LIF的情况下扩增细胞。

优选地，促进自我更新的条件包括连续传代。优选地，促进自我更 新的条件包括至少12次连续的传代。

在优选实施方式中，祖细胞系相对于胚胎干细胞而言潜能有所减小。 优选地，祖细胞系是细胞系限制的，优选是非亚全能型的。优选地，祖 细胞系是不会导致形成肿瘤的。

优选地，获取祖细胞系的步骤包括把胚胎干细胞暴露在加强向特定 细胞系分化的条件中。优选地，加强分化的条件包括从胚胎干细胞中产 生类胚体。优选地，在失去亚全能性之后从加强分化的条件中移开。

优选地，把该细胞从促进细胞系限制的条件中移除的过程包括分离 类胚体。优选地，该方法包括分离已经生长了约3-6天的类胚体。

在优选实施方式中，祖细胞系呈现出OCT4和碱性磷酸酶活性表达的 减弱或基本不表达。

优选地，祖细胞系表现出相对于其来源的胚胎干细胞而言亚全能性 标记的减弱表达，该亚全能性标记优选从由下列物质所构成的组中选择： Nanog、BMP4、FGF5、Oct4、Sox-2以及Utf1。