[发明专利]人平滑肌细胞的获得方法及其用途

权利要求书

1.从人肌活检细胞样品或从体外分化成为人骨骼肌细胞的人肌活检细胞中体外获得主要包括表达钙调节蛋白和平滑肌肌球蛋白重链的人平滑肌细胞的细胞群的方法，

-所述人肌活检细胞不表达CD31和CD14，以及如果适合，不表达B和T淋巴细胞标志物，和

-所述人骨骼肌细胞表达CD56、结蛋白和选自MyoD、Myf5和肌形成蛋白基因的肌形成基因，并能产生多核肌管，

其特征在于，包括如下步骤：

A)在包含VEGF的培养基中培养所述成肌细胞的人肌活检细胞，在没有膀胱平滑肌细胞的情况下进行所述培养；和

B)回收步骤A获得的人平滑肌细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，表达CD56和结蛋白的所述人骨骼肌细胞表达MyoD、Myf5和肌形成蛋白基因。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述人骨骼肌细胞不表达CD34和CD14。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人骨骼肌细胞不表达钙调节蛋白和平滑肌肌球蛋白重链。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A获得的所述人平滑肌细胞表达钙调节蛋白和平滑肌肌球蛋白重链。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A获得的所述人平滑肌细胞不表达MyoD基因。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤A从体外分化成为人骨骼肌细胞的人肌活检细胞中获得的所述人平滑肌细胞比步骤A采用的所述人骨骼肌细胞表达CD56和结蛋白的量明显较少。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤A获得的所述人平滑肌细胞表达Myf5和肌形成蛋白。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A采用的所述培养基还包括至少一种生长因子，所述至少一种生长因子选自PDGF-BB、IGF1、FGFb、HGF、TNFα、和TGFβ。

10.如权利要求1所述的方法，其中从体外分化成为人骨骼肌细胞的人肌活检细胞样品中获得所述人平滑肌细胞，其特征在于，通过包括如下步骤的方法从人肌活检细胞样品中获得所述人骨骼肌细胞：

a)切碎所述肌活检样品，

b)酶裂解纤维和肌细胞并通过过滤分离个体细胞，

c)在存在生长培养基和/或分化培养基的情况下在粘附细胞的培养反应器中培养该方法获得的肌细胞，如果适合，接着一个或几个扩增期，

d)通过分析特异性的细胞标志物鉴定在培养不同阶段存在的细胞类型，

e)选择所需细胞类型为细胞群主要部分的培养阶段，

f)在e)选择的培养阶段收集细胞群，

g)如果适合，深度冷冻步骤f)收集的细胞。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，

-在步骤b)，进行如下步骤：

-洗涤培养基A中的切碎物，接着在存在释放酶的情况下酶裂解所述切碎物；

-分离通过滤网过滤获得的个体细胞，接着离心；和

-洗涤培养基B中获得的沉淀细胞；

-在步骤c)，进行如下步骤：

-在培养板上于培养基C中培养步骤b)获得的细胞，直到它们20-50％汇合或直到第一个肌管出现，接着在磷酸盐缓冲盐水中、在FCS中、随后在培养基C中洗涤细胞，接着在大培养板上或培养瓶中于培养基C中再次培养，获得约90％汇合程度或第一个肌管出现，

-收集所述细胞的前一天除去培养基C并用培养基D替换，

-在磷酸盐缓冲盐水中接着在培养基A中洗涤获得的所述细胞；和，

-如果需要，在补充了0.5％(P/V)人白蛋白血清的培养基A中浓缩步骤f)结束时获得的所述细胞；

-在步骤g)，在补充了4％(P/V)人白蛋白血清和7.5％(V/V)DMSO的培养基A中进行深度冷冻步骤f)获得的所述细胞，在37℃解冻，接着用培养基A洗涤后，在所述培养基中悬浮，在以上步骤中，所述培养基A、B、C和D如下：

培养基A：

-改良的MCDB120培养基：D-缬氨酸取代L-缬氨酸，去除酚红和胸苷；

培养基B：

-培养基A+20％照射的胎牛血清+抗生素；

培养基C：

-培养基B+10ng/ml的FGFb+1μM地塞米松；

培养基D：磷酸盐缓冲盐水。