[发明专利]用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒

说明书

领域

本发明一般涉及用于扩增核酸同时减少非特异性荧光和不需要的扩 增产物的组合物、方法和试剂盒。

介绍

尽管聚合酶链式反应(PCR)及相关的技术对于各种应用是高度有用 的，但是由于不理想的副反应而引起的非靶核酸的扩增可能存在显著的问 题。这样的副反应可以作为非靶核酸的错误引发和/或引物寡聚化(有时也 叫作引物二聚体形成)，以及这些引发的假体(artifacts)的后续扩增的结 果而发生。在使用具有显著的背景核酸而靶核酸以低拷贝数存在的核酸混 合物进行PCR的应用中，这是特别实际的(参见，例如，Chou等，Nucl.Acids Res.(核酸研究)20：1717-1723(1992))。非特异性扩增产物的产生已经至 少部分归因于延长非特异性退火的引物的环境温度下的DNA聚合酶活性 (参见，例如，id.；Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院学报) 87：4580(1990))。因此，在环境温度下抑制DNA聚合酶的活性有利于控 制次级扩增子的产生。

已经描述了一些技术，据说其减少不需要的次级扩增产物的形成。按 照某些“手工热启动”技术，直到混合物的温度足够高足以防止非特异性 引物退火时才加入对DNA聚合酶活性重要的成分(例如，二价离子和/或 DNA聚合酶本身)到反应混合物中(参见，例如，Chou等，Nucl.Acids Res. (核酸研究)20：1717-1723(1992)；和D’Aquila等，Nucl.Acids Res.(核酸 研究)19：3749(1991))。较少劳动力-密集型技术应用扩增反应的至少一种 成分的物理分离或可逆失活。例如，镁或DNA聚合酶可以隔离在蜡珠中， 当反应温度升高时蜡珠熔化，只在升高的温度释放所隔离的成分。按照其 它的技术，对DNA聚合酶进行可逆地失活或修饰，例如，通过DNA聚合 酶的可逆的化学修饰或与抗体的结合(参见，例如，Birch等，美国专利号 5,677,152)。在升高的反应温度，所述化学修饰被逆转，或者所述抗体分 子变性，释放出功能性DNA聚合酶。然而，一些这样的技术似乎是有漏 洞的，原因在于在更低的反应温度，一些DNA聚合酶活性是可检测到的， 或者它们需要将反应混合物延长暴露于高温才能完全使得DNA聚合酶失 活。

某些目前所用的核酸扩增技术包括检测和/或定量扩增产物的步骤，其 包括核酸染料，例如但不限于，SYBRGreen I(分子探针(Molecular Probes)，Eugene，OR)，包括某些实时和/或终点检测技术(参见，例如， Ririe等，Analyt.Biochem.(分析生物化学)245：154-60(1997))。典型地， 所述核酸染料与扩增产物的双链片段和/或引物-模板双链体缔合，并且在 特别的核酸染料所特有的波长发射可检测的荧光信号。某些扩增方法包括 评估扩增产物的纯度的检测步骤，其包括核酸染料，例如但不限于，PCR 后解离曲线分析，其也叫作解链曲线分析。由于扩增子的解链曲线特别取 决于它的长度和序列，所以扩增子通常可以通过它们的解链曲线而区分 (参见，例如，Zhang等，Hepatology(肝脏病学)36：723-28(2002))。解 离或解链曲线可以在特定的扩增反应过程中当反应温度经过所述扩增子 的解链温度时通过检测核酸染料的荧光而获得。双链扩增子的解离观察为 在所述核酸染料特征性发射波长的荧光的突然减少。按照某些解离曲线分 析技术，当解链曲线表现出单一的、一致的解链温度时，有时在荧光强度 的负导数相对温度(-dF/dt相对T)的图上绘图性表示为一个峰，那么将扩增 产物分类为“纯的”。例如，在来自单丛扩增的这样的解离曲线中出现多 个峰典型地表明存在不需要的副反应产物。当应用这样的基于核酸染料的 扩增产物检测技术时，通常理想地：1)至少减少并且优选地消除不需要的 副反应产物的形成，和2)至少减少并且优选地消除由其它核酸，即非扩 增产物的双链片段的变性导致的荧光峰。

除此之外，由于引物、连接探针、裂解探针、启动子-引物等的非特异 性退火，以及随后在亚最佳温度的酶活，某些其它扩增技术也可以产生不 需要的扩增产物。例如，尽管反应成分通常是室温下结合，或者尽管反应 组合物被加热到需要的反应温度。这些技术中至少有一些可以受益于背景 荧光的减少。

发明概述