[发明专利]细胞培养方法以及进行该方法的设备

说明书

本发明涉及通过包括以下部件的设备培养细胞：

-具有顶盖顶盖的培养容器，其中设置有至少一个第一区和至少一个第二 区，所述第一区是基本不含任何细胞的培养基的转移区，而所述第二区是细胞 培养区，所述第一区位于第二区内部，

-使培养基循环通过培养区的循环培养基的装置，所述培养区包括底壁和 顶壁，各壁具有能够转移基本不含细胞的培养基的开口。

这种培养设备是已知的，例如可从专利US 5 501 971中得知，该专利描述 了一种培养容器，其中在内部培养基转移管道之外设置有培养区。细胞被置于 外部培养区内，其类型为含有载体的篮子，培养基通过该培养区从顶部向底部 流动。然后从培养区底部回收培养基，培养基在培养基循环设备的作用下通过 上述管道进入培养容器顶部，然后再通过培养区。专利US 5 507 971描述了一 些替代方案，但培养基总是从顶部到底部通过培养区。

这种设备的一个缺点是，它不适用于所有类型的细胞培养。实际上，这种 设备仅设计用于在固定床或紧密填充床的微载体上培养细胞，绝对不适合悬浮 液或流化床中的微载体上培养细胞。实际上，在专利US 5 501 971的设备中， 不含载体或微载体的悬浮液中的细胞或非固定载体上的细胞有在重力作用下 沉降并聚集在培养区底部的趋势，并且，由于培养基从上到下流经该培养区， 更加重了这种细胞聚集在培养区底部。因此，细胞层层堆叠并相互接触，从而 使细胞无法充分获取该区域中的物。

在专利US 5 501 971的反应器中，当在非固定载体或微载体上培养非常脆 弱而几乎经不起任何应力的细胞时，细胞会经受重力、培养基向下流动以及载 体重量的作用，这会极大损害培养物的存活率。此外，对于专利US 5 501 971 的生物反应器而言，采用悬浮培养是难以想像的，因为悬浮的细胞决不能经历 细胞和细胞接触。实际上，如果存在这种接触，细胞之间便会形成蛋白质键并 聚集。这种聚集导致细胞由于缺乏氧气和养料而死亡。

本发明的目的是减轻现有技术的缺点，方法是获得一种培养设备，该设备 同时培养悬浮液中的细胞和载体或微载体上的依赖于贴壁的细胞，并能确保对 细胞的应力最小同时防止细胞聚集在培养区底部。

为解决该问题，本发明提供了如本文开始时提到的设备，其特征在于，该 设备还包括至少一个第三区和至少一个第四区，这两个区都是基本不含细胞的 培养基转移区，所述第三区是所述第二区之内和所述第一区之外的区域，而所 述第四区是是所述第二区之外的区域，所述第三区与第一和第二区培养基连 通，而所述第四区经培养基循环装置与第二区(培养区)和第一区(培养基转移区) 培养基连通，且培养基循环装置能够使培养基在所述第二培养区内从底部循环 到顶部。

所述第四区更具体包括一定体积的由生物反应器环境大气构成的气体，并 且还构成该培养基的氧合区。

因此，从底部到顶部通过第一培养基转移区的培养基到达第一培养基转移 区顶部并溢入与第一区培养基连通的第三区，培养基在循环装置、重力以及连 通容器效应的作用下向下流动，通过第二培养区底壁上的培养基通道开口，然 后又在连通容器效应或培养基循环装置或者这两者的作用下向上流向培养区 顶部，之后又溢入经循环装置与第一培养基转移区连通的第四培养基转移区。 培养基循环装置之后又立即使培养基到达第一培养基转移区顶部并重新开始 循环。因此，得益于培养基的流动部分抵消了重力作用，培养区内的细胞便可 随培养基从底部流向顶部。流动使单独的细胞或微载体上的细胞在培养区内更 好地分散并降低了对它们的有害应力。

当使用术语“载体或微载体上的细胞”时，必需理解，所述载体可以在固 定或填充床内、或在流化床内。

同样，当使用术语“细胞培养物”或“细胞”时，必需理解，尤其是当提 及动物细胞时，它可以指病毒产物、蛋白质或其他重组产品、细胞代谢物、组 织细胞培养物(可能在三维载体上)、干细胞或者细菌或酵母。

本领域技术人员将容易理解，载体或微载体上的细胞受填充的影响小于无 载体或无微载体的悬浮液中的细胞，在固定床中尤其如此，尽管如此，技术人 员仍旧容易发现培养区内这样的流动方向对于培养物氧合和营养物分布的优 势。实际上，已经众所周知细胞培养的关键步骤是培养容器的设计。培养容器 的设计必需满足无新鲜培养基无法到达或者细胞会发生聚集的死角；细胞直接 与培养基接触而非相互接触对于它们的繁殖和/或生产代谢也是非常有利的。