[发明专利]核酸的一级结构变化的解析方法

说明书

技术领域

本发明涉及适于判定核酸突变的核酸的一级结构变化的解析方法。

背景技术

随着人类基因组的碱基序列的解读完成，依据该解读信息的染色体上的基因的位置信息变得明了。另外，由该位置信息出发，面向与成为癌症发病原因的各种染色体结构的变化、即核酸的一次结构变化相关的诊断实用化的研究正在进行。为了网络地解析核酸的一级结构的变化，有阵列CGH法，该方法使用点样有数百～数千、有时数万个映射于染色体上的cDNA克隆或BAC克隆的微阵列，从细胞中提取核酸，并将整个核酸扩增或者不扩增而进行荧光标记，通过进行杂交，从而解析杂合子的缺失(以下简称为LOH)。

在利用阵列CGH法的解析中，公开了使用配置有存在于20q13的基因克隆的阵列的与乳腺癌诊断相关的解析法(参照专利文献1)，通过该方法，可以发现确认染色体部位的变化、即核酸一级结构的变化，可以应用于癌症的诊断等中。另外，公开了使用SNP标记物，利用微阵列来进行染色体结构的解析，从而进行膀胱癌的诊断的方法(参照非专利文献1)。

另一方面，作为利用电泳来解析染色体上更深入区域的方法，开发了使用显示数个～数十个多态性的DNA标记物、即SNP标记物或微卫星标记物的解析法。作为这种解析法，公开了利用微卫星标记物的不稳定性解析来诊断癌症的方法(参照专利文献2)、利用SSCP标记物的消失解析来诊断癌症的方法(参照专利文献3)。这些方法是通过利用电泳来测定由PCR法获得的标记物的标记物长或结构的差别而进行解析的，当标记物为杂合子时，两个片断以电泳图像表现出来。例如，在癌症中，某个标记物在患者的正常组织中为杂合性，在肿瘤组织中的杂合的标记物中，产生由于染色体结构异常而一者消失的LOH。

多有报告指出，在使用这种方法时，由于多态标记物本身有缺失，因此该位置的染色体结构会产生异常。另外，进行这种解析时，各种DNA标记物登载在公共的数据库中，在解析标记物时使用的引物序列等也是公开的，通过利用它们，可以更高精度地解析数据。

专利文献1：美国专利第6268184号说明书

专利文献2：美国专利第6291163号说明书

专利文献3：日本特开平9-201199号公报

非专利文献1：Cancer Res.，63，2216-2222(2003)

但是，专利文献1和非专利文献1所记载的利用阵列CGH法的解析在制作阵列时需要时间和费用，实验操作也很复杂，因此具有作为临床现场中使用的方法无法实用的问题。另外，由于对从细胞中提取的整个核酸进行标记化、并进行杂交，因此通过交叉杂交等有时会出现噪音，具有难以定量地获得正确数据的问题。

另外，使用多态标记物并利用电泳的解析法有时由于患者的基因型而成为纯合，不能进行定性解析，并且实验操作复杂、需要时间，而且难以正确地定量靶基因，因而具有作为临床现场中使用的方法无法实用的问题。

因此，只要DNA标记物可以与患者的基因型无关地定量地可见，则可以提高检测灵敏度，另外，即便不具有多态性，只要是映射于染色体上的核酸序列，即可定量解析核酸序列的一级结构变化。而且，只要能够校正利用PCR等进行的核酸扩增工序的不均，则可以通过更为简单的操作，高精度且迅速地解析核酸的一级结构变化，作为临床现场使用的方法是有用的。

发明内容

本发明鉴于上述事实而完成，其目的在于提供核酸一级结构变化的解析方法，其具有定量性、灵敏度和重现性高、可以迅速且低成本地进行。

为了解决上述问题，本发明如下构成。