[发明专利]在基因表达中有用的转录激活因子的DNA结合位点

权利要求书

1.经分离的多核苷酸，其包含针对PrtT转录激活因子的双链DNA结 合位点，其中，所述位点第一链的至少32个碱基与5′-G/C(N)₅C C G A/T C G G(N)₁₉G/C-3′(SEQ ID NO：22)在序列上相同，所述位点的第二链 与所述第一链互补，并且，PrtT与所述位点的结合将激活宿主细胞中下游 核苷酸序列的转录。

2.经分离的多核苷酸，其包含双链、经突变的、非功能性的DNA结 合位点，其中，未经突变的位点第一链的至少32个碱基与5′-G/C(N)₅C C G A/T C G G(N)₁₉G/C-3′(SEQ ID NO：22)在序列上相同，所述经突变 的、非功能性的位点的第二链与所述第一链互补，所述未经突变的位点能 与PrtT转录激活因子结合，PrtT与所述未经突变的位点的结合将激活宿主 细胞中下游核苷酸序列的转录，但是所述经突变的、非功能性的位点的第 一链中的至少一个碱基较之所述未经突变的位点的核苷酸序列而言有所改 变，使得PrtT不再结合所述经突变的、非功能性的位点，或者使得PrtT 不再激活下游核苷酸序列的转录。

3.经分离的多核苷酸，其包含双链、经突变的、增强的DNA结合位 点，其中，未经突变的位点第一链的至少32个碱基与5′-G/C(N)₅C C G A/T C G G(N)₁₉ G/C-3′(SEQ ID NO：22)在序列上相同，所述经突变 的、增强的位点的第二链与所述第一链互补，所述未经突变的和经突变 的、增强的位点能与PrtT转录激活因子结合，PrtT与所述未经突变的或所 述经突变的、增强的位点的结合都将激活宿主细胞中下游核苷酸序列的转 录，但是所述经突变的、增强的位点的第一链中的至少一个碱基较之所述 未经突变的位点的核苷酸序列而言有所改变，使得下游核苷酸序列的转录 增强。

4.重组表达载体，其包含在启动子中的如权利要求1或3所述的DNA 结合位点、转录终止信号和翻译终止信号。

5.权利要求4所述的载体，其还包含编码多肽的下游核苷酸序列，其 中，所述下游核苷酸序列的转录受PrtT激活。

6.宿主细胞，其包含权利要求2或3的多核苷酸或权利要求4或5的 表达载体。

7.鉴定蛋白酶的方法，其中所述蛋白酶的表达受PrtT转录激活因子的 调控，所述方法包括：

(a)探测出在(i)真菌细胞和(ii)该转录激活因子遗传缺失(Δ prtT)的真菌细胞中差异表达的基因，以及

(b)将编码蛋白酶的差异表达的基因鉴定为蛋白酶基因。

8.经分离的蛋白酶，其是通过权利要求7的方法鉴定的。

9.经分离的多核苷酸，其编码权利要求8的蛋白酶。

10.宿主细胞，其中所述宿主细胞基因组中至少一个DNA结合位点根 据权利要求2被突变，使得PrtT不能结合经突变的位点，或者使得PrtT 不能激活下游核苷酸序列的转录。

11.一种方法，用于生产权利要求10的宿主细胞，所述方法包括：

(a)通过诱变或重组，将至少一个经突变的、非功能性的DNA结合 位点引入所述宿主细胞的启动子，以及

(b)可选地，通过PrtT与所述经突变的、非功能性的位点的结合的 降低或宿主细胞中PrtT依赖性转录激活的降低来进行验证。

12.宿主细胞，其中，一个或多种所述宿主细胞的蛋白酶基因中的 DNA结合位点根据权利要求2被突变，使得PrtT不能结合经突变的位 点，或者使得PrtT不能激活该蛋白酶基因的转录，从而导致产生具有降低 的蛋白酶表型的宿主细胞。