[发明专利]多核苷酸扩增

说明书

技术领域

本发明涉及特定多核苷酸扩增的领域。

背景技术

为了理解生命本身呈现的不同状态的因果关系，人们需要发现导 致该因果关系的因素和过程。在这个探索中的一个中心因素是基因组， 在基因组中信息通过以高度保守方式增殖而繁殖的方式储存。在执行 包含在基因组中的信息时，DNA被转录成RNA并进而翻译成蛋白质。 对基因组(DNA)、转录组(RNA)和蛋白质组(蛋白质)的研究近年 来已经大大地促进了我们对生命的分子基础的理解。

存在大量的体外比较RNA样品的可能性。早期的方法是差示杂交 或差示筛选的方法(Rebagliatietal.，1985)。它涉及从cDNA文库中少 量地挑选随机克隆(或序列)并检查它们在RNA样品中不同浓度中的 存在。必须投入巨大的劳动量来鉴定单个的差异表达的转录物，因为 认为它们的总数低于1％。已经提出减除杂交法来通过在筛选前富集差 异表达的转录物克服这个问题。通过引入高密度微阵列做出了处理丰 度问题的另一种途径。在使用微阵列技术时，与目标基因的RNA相符， 点样100s到1000s的cDNA并将其结合到表面。它们通常来源于测序 的EST文库并且-假如不是多余的-能覆盖同配备到膜上的点一样多的 转录物。简言之，将从目标细胞或组织抽提的RNA进行标记，例如在 反转录时，并杂交到这些微阵列上。然后能比较在两个或更多个RNA 制备物间的相应点的信号强度。即使该技术已经产生了大量的数据， 所有这些杂交技术都存在两个主要的缺点。其中一个是交叉杂交。这 意味着，杂交时两条DNA分子的整条链不必都是互补的。因此，这为 同微阵列的点杂交(结合)的分子的鉴定引入了错读。第二点，人们 只能比较已经点样的分子，这限制了对存在于用来产生微阵列的文库 中的序列的寻找。

在1992年引入了今天通常称为“差异显示”(DD)(Liangetal.， 1992；Welshetal.，1992)的可选方法。在DD中，在反转录(RT)过程 中，首先将样品的总mRNA群体分成确定的cDNA群(pools)。通过 用一个、两个或X个碱基锚定的寡寡脱氧胸苷酸引物启动RT，将样品 分割成3、12或3×4^x-1个部分而完成该方法。这些锚点碱基(anchor base)同紧邻聚腺苷酸尾上游的碱基杂交。因此，选择待反转录的mRNA 分子其碱基紧邻聚腺苷酸尾上游的序列同该引物的锚点碱基互补。在 随后的聚合酶链反应(PCR)中，使用随机引物和锚定引物来扩增确 定的cDNA群。在通过大小分离它们的胶上将相应的群并排跑胶。以 带的强度差异反映表达水平的差异。将目标带从胶上切下，再扩增并 测序。最初的DD的一个缺点是，它使用随机引物进行扩增。这样的 鸟枪法能通过覆盖转录组多次而达到仅是统计学上的全转录组覆盖。 因此，在展示中必须将某些RNA分子提呈多次而其他的RNA分子可 能根本不用提呈。

近来引入了以更系统的方式扩增RNA群的方法((Prasharetal.， 1996；Prasharetal.，1999)。大体而言，涉及三个额外的步骤。在第一 链cDNA合成后，进行第二链合成来得到能用限制酶切割的双链 DNA。在第三个步骤中，将接头连接到片段的5’端。然后用一个与5’ 接头序列互补的引物和用于RT的锚引物PCR扩增这些片段。该文作 者评价，每一个6-碱基切割限制酶从mRNA的3’聚腺苷酸尾的50和 400碱基间的位置切割8％的cDNA。因此，为了接近转录组的彻底覆 盖，必需超过12种的限制酶。Matzetal.(1997)用利用了PCR抑制 效应(suppressioneffect)优点的“有序差异显示”的引入描述了该方 法多少更巧妙的变化。