[发明专利]具有由GnT－V转移的GlcNAc的糖链的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及由N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V(下文中称为GnT-V) 合成的糖链的检测方法，更特别地涉及用于精确检测转移性癌特征性 的糖链的方法。

背景技术

用于测定蛋白质的N-连接糖链的支链结构的糖基转移酶的实例 包括N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-III(Gnt-III)，-IV(Gnt-IV)，-V (GnT-V)，-VI(GnT-VI)等。如图5中所示的，这样的N-乙酰氨基 葡萄糖转移酶在转移和添加非还原性末端N-乙酰氨基葡萄糖 (GlcNAc)至每个特异性支链中起作用。已经添加的糖链涉及各种生 命机能。

例如，GnT-III在复合或混合型的N结合型糖链上合成二等分的 GlcNAc残基。英国的Dwek博士等人发现了BSE朊病毒蛋白比正常的 朊病毒蛋白具有较少的通过GnT-III添加的糖链。降低的GnT-III基 因表达可以提高疾病相关的朊病毒蛋白。还提出了GnT-III具有抑制 癌转移的作用，如黑素瘤的肺转移，抑制乙肝病毒(HBV)增殖的作 用，抑制HBV相关蛋白质分泌的作用和提高IgG活性的作用。

GnT-V在N-连接糖链上合成GlcNAc β1-6Manα1-6Manβ1-4的支 链。尽管N-连接糖链中的分支侧链的数量通常为3至4个，该数量 将随着器官变成癌性的或随着T-淋巴细胞变成激活的而增加。侧链 数量的增加导致聚-N-乙酰氨基乳糖含量的增加，已知聚-N-乙酰氨基 乳糖的含量是由癌症引起而增加的。已知在N-乙酰氨基葡萄糖转移 酶-V的基因已经受到破坏的小鼠中癌症的转移受到抑制并且在高度 转移的癌症中提高了GnT-V活性。此外，指出了GnT-V不仅涉及癌转 移，而且涉及癌形成，因为GnT-V的表达在肝癌形成过程中的癌变初 期提高了。

发明公开

在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶中由GnT-V合成的糖链在生命机理和 疾病治疗中特别有用，因为它起着与癌转移相关的生命信息物质的作 用。因此，对于精确鉴定具有由GnT-V转移的GlcNAc的糖链存在着 需求。

凝集素是特异性结合细胞膜表面上糖蛋白或糖脂中所含糖链的 蛋白质。凝集素具有如下的作用：当凝集素识别糖蛋白中的糖链并结 合糖链时，在细胞是血细胞的情况中，将引起血凝反应，在细胞是细 菌的情况中，将引起细胞凝集。利用凝集素的特异性识别作用和凝集 作用，已经研发了临床诊断剂，试剂，治疗剂等。

小麦胚芽凝集素，菜豆凝集素等已知为特异性识别添加了N-乙酰 氨基葡萄糖(GlcNAc)的糖链的凝集素。通常认为凝集素具有特异性 结合特定糖链的特征。然而，目前已知的GlcNAc-特异性凝集素没有 满足上述的需求来精确鉴定由GnT-V合成的糖链，因为目前已知的 GlcNAc-特异性凝集素不仅识别由GnT-V转移的糖链，而且识别由 GnT-III和GnT-VI合成的糖链。因此，在现有的情况中难以使用单 个凝集素来精确鉴定具有由GnT-V转移的GlcNAc的糖链。

本发明提供了可靠且高度精确地检测，纯化和筛选具有由GnT-V 转移的GlcNAc的糖链的方法。

本发明人致力于研究上述的问题。作为研究的结果，他们发现了 两种类型的GlcNAc-特异性凝集素：一种识别具有由GnT-V转移的 GlcNAc的糖链的凝集素和一种不能识别这种糖链的凝集素，并且发 现结合使用这两种类型的凝集素可以解决上述问题。也就是说，根据 本发明的检测具有由GnT-V转移的GlcNAc的糖链的方法的特征在于 结合使用至少一种对具有由GnT-V转移的GlcNAc的糖链具有亲和性 的GlcNAc特异性凝集素和至少一种对具有由GnT-V转移的GlcNAc的 糖链不具有亲和性的GlcNAc特异性凝集素。在本发明的检测方法中， 重要的是使用两种不同类型的GlcNAc-特异性凝集素。可以同时使用 这些凝集素或按时间顺序使用，换句话说，在两个阶段的操作中使用。 在两阶段操作中，可以优先使用任一种凝集素。

在本说明书中，术语“糖链”用来包括所有的游离寡糖，用Cy3 荧光标记的糖链，氨基吡啶或其类似物，糖氨基酸，糖肽，糖蛋白， 蛋白多糖，细胞等，只要糖链是N-连接的糖链。糖蛋白包括高甘露 糖型，混合型，复合型等的那些。此外，可以使用由单独使用，结合 使用或按顺序使用唾液酸酶，半乳糖苷酶，N-乙酰己糖胺酶和岩藻糖 苷酶部分降解上述糖链获得的物质。