[发明专利]对映选择性环氧化物水解酶和用其制备对映纯环氧化物的方法

说明书

发明领域

本发明涉及对映选择性环氧化物水解酶和用对映选择性环氧化物水解酶水解各种环氧化物底物从而制备具有对映纯活性的环氧化物的方法。 

发明背景 

很多生物活性物质如药物以不同的对映体形式存在，只有特定的对映体才具有所需功效，其余的对映体会导致严重的不良反应。在安全性和生物活性方面，必须得到单一对映体，因此，可对合成对映纯生物活性物质进行许多研究。 

对映纯环氧化物和邻二醇为制备对映纯生物活性化合物如药用化合物、肽类和功能性食品的通用合成中间体(Grogan，et al.，FEMSMicrobiol.Lett.，141：239-243，1996；Arahira，et al.，Eur.J.Biochem.，267：2649-2657，2000)，因为这些化合物具有优良的反应性并可诱导各种反应。 

特别地，可用手性化学催化剂和酶制备对映纯环氧化物，只有单一对映体是通过用环氧化物水解酶进行选择性水解得到外消旋底物中的各个对映体来制备的。在不久的将来，该方法可被用于商业，因为其可将廉价的外消旋底物变为具有高附加值的对映纯环氧化物。环氧化物水解酶只对映选择性地将外消旋环氧化物底物中的(R)或(S)-对映体水解为二醇而剩下其他类型的对映体，从而得到对映纯环氧化物。此外，环氧化物水解酶对(R)或(S)-对映体的对映选择性取决于微生物和底物结构。 

环氧化物水解酶(EHase；EC 3.3.2.3)为常见的酶，已从各种来源如细菌、酵母、真菌、昆虫、植物和哺乳动物中分离(Weijers，et al.，J.Mol.Catal.B Enzym.，6：199-214，1999；Archelas，&Furstoss，Curr.Opin.Chem.Biol.，5：112-119，2001)。由于在通过对映选择性EHase的动力学拆分来制备对映纯环氧化物中的潜在应用，已对几种EHase进行研发(Tokunaga，et al.，Science，277：936-938，1997)。 

但是，对映选择性EHases的数量有限，这需要研究开发新型对映选择性EHases用于在药学工业中制备对映纯环氧化物。 

大多数EHases为α/β水解酶家族成员，该家族包括蛋白酶、脂肪酶、酯酶、脱卤素酶和过氧化物酶(Nardini，&Dijkstra，Curr.Opin.Struct.Biol.，9：732-737，1999；Rick，et al，.J.Am.Chem.Soc.，121：7417-7418，1999)。α/β区域由被α螺旋环绕的核心—平行或混合β层构成。这些酶的特征为采用两步机理，其中酶的催化亲核部分先进攻共价中间体的极性亲电底物，然后再将其水解(Yamada，et al.，J.Biol.Chem.，275：23082-23088，2000)。α/β水解酶折叠酶的保守催化三元体(triad)由亲核残基(Asp或Ser)、酸性残基(Asp或Glu)和保守组氨酸残基构成。亲核基团适合保守的氨基酸序列基序，Sm-X-Nu-Sm(Sm＝小残基，X＝任何残基，Nu＝亲核基团)。其它保守的氨基酸序列为包含酶的含氧的阴离子洞(oxyanion hole)的HGXP基序(Ollis，et al.，Protein Eng.，5：197-211，1992)。 

但是，EHases中—级序列的保守性仅限制在关键区域的2或3个氨基酸，这使得通过同源检索进行筛选比较困难。 

发明简述 

本发明的发明者通过筛选来自各种海洋环境的赤细菌(Erythrobacter sp.)、鞘氨醇细菌(Sphingopyxis sp.)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)和红细菌(Rohdobacterium sp.)，分析它们基因 组的ORF序列确定候选基因，并表达候选基因发现了具有高对映选择性水解活性的环氧化物水解酶。 

本发明的目的为提供来自海洋环境的可产生高对映纯环氧化物的对映选择性环氧化物水解酶蛋白。 

本发明的另外的目的为提供通过采用对各种环氧化物底物具有高对映选择性的环氧化物水解酶蛋白制备对映纯环氧化物的方法。