[发明专利]用于测量血浆和组织鞘磷脂和磷脂酰胆碱的酶促方法

说明书

背景技术

除了胆固醇和甘油三酯之外，脂蛋白还包含磷脂，其中磷脂酰胆碱 (PC)和鞘磷脂(SM)是两种主要成分，前者占约70％的总磷脂，后 者占约20％的总磷脂。在人病例对照研究中显示出，血浆SM和SM/PC 比率均是冠心病的独立危险因素。

一段时间内众所周知的是，SM在人类和动物模型的动脉粥样化中 积累。由人动脉粥样硬化病灶提取的低密度脂蛋白(LDL)在SM中大 大多于来自血浆的LDL。apoE基因敲除(apoE KO)小鼠中血浆SM 水平高于野生型小鼠中血浆SM水平的4倍，这可以部分解释为何这些 动物中动脉粥样硬化增加。来自高胆固醇血症兔子的VLDL中的SM/PC 比率要高5倍。

近来，已经证实，给apoE基因敲除小鼠施用多球壳菌素(myriocin) (一种SM合成抑制剂)可显著地降低SM，增加PC，并且因此降低血 浆中SM/PC比率，明显减少动脉粥样硬化损伤面积。这些数据表明， 在动脉粥样硬化的发展中，SM可能起到促进作用，而PC则可能起到 预防作用。对它们的测量可以提供对人类以及多种小鼠模型中动脉粥样 化形成的新视点。

尽管两种磷脂的重要性都非常明显，但是还没有用于其测量的简 单、快速、灵敏并且高通量的方法。传统上，血浆SM和PC通过脂类 提取、薄层层析和在分离的SM或PC点上测定磷酸盐来测量。此方法 耗时且不灵敏。

由此，需要一种测量SM和PC的新方法。

发明内容

本发明涉及用于测量血浆和组织鞘磷脂和磷脂酰胆碱的方法，所述方 法包括：1)利用细菌鞘磷脂酶(SMase)催化鞘磷脂水解成磷酸胆碱和 n-酰基鞘氨醇；2)利用碱性磷酸酶从步骤1)产生的磷酸胆碱得到胆碱； 3)通过添加胆碱氧化酶产生过氧化氢；和4)添加过氧化氢并且利用DAOS (N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，钠盐)、4-氨基安替比林 和过氧化物酶，产生蓝色至紫色染色，优选最佳吸收为595nm。

在另一个实施方案中，所述方法包括：1)利用细菌磷脂酶D催化 磷脂酰胆碱水解成胆碱和磷脂酸；2)通过添加胆碱氧化酶产生过氧化 氢；和3)添加过氧化氢并且利用DAOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙 基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐)、4-氨基安替比林和过氧化物酶，得到蓝色 至紫色染色，优选最佳吸收为595nm。

在另一个实施方案中，通过结合上述两种方法来同时测量磷脂酰胆 碱和鞘磷脂。

具体实施方式

传统上，通过4个步骤测量SM和PC：1)脂类提取；2)薄层层 析(TLC)；3)从TLC板上相应的点提取SM和PC，和4)在各个提 取物中定量磷酸盐。整个过程耗时且不灵敏。尽管存在测量包含胆碱的 总磷脂(PC+SM)的简单方法(Wako Pure Chemical)，却没有相应的 方法用于直接测量SM和PC。本发明涉及两种快速、特异性和灵敏的 用于血浆SM和PC测量的测试法。

本发明涉及两种快速、特异性和灵敏的用于鞘磷脂(SM)和磷脂酰胆 碱(PC)的酶促测量法。(SM)和(PC)是血浆脂蛋白上的两种主要磷 脂。它们的浓度传统上通过脂类提取、薄层层析和在分离的SM或PC点 上测定磷酸盐来测量。

在本发明的方法中，将血浆与细菌鞘磷脂酶(用于SM测量)或细 菌磷脂酶D(用于PC测量)、碱性磷酸酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶、 N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺和4-氨基安替比林一起 培养，优选约45分钟。产生最佳吸收在595nm的蓝色染色。

PC水平不影响SM测量，或者SM水平不影响PC测量。SM测量 的线性范围为约0.5至约5μg，PC测量的线性范围为约2.5至约20μg。 测试法的批间变异系数对于SM为约1.7±0.05％，对于PC为约 3.1±0.13％。可将这两种方法进行修正以适应自动化，并且可以适用于 大规模、高通量的测试法。

利用鞘磷脂酶和磷脂酶D使我们的测试法具有特异性。然而，并非所 有的市售酶都可用。一些磷脂酶D可能被鞘磷脂酶活性污染，或者一些鞘 磷脂酶可能被磷脂酶D活性污染。优选将来自BIOMOL International的 磷脂酶D用在本发明的方法或测试法中。

术语“测试法”和“方法”在本文中具有相同的含义并且在本文中 可互换使用。