[发明专利]用于亚硫酸氢盐处理的新方法

说明书

技术领域

本申请涉及一种用于执行亚硫酸氢盐反应以确定核酸中的甲基化 的位置，即，甲基化的和非甲基化的胞嘧啶的方法。在该方法中，核酸 被亚硫酸氢盐处理并结合在固相上，此时加入碱性溶液用于脱磺酸基并 将核酸从固相中洗脱。核酸可在另外的步骤中被扩增。所述固相优选为 包括玻璃或二氧化硅的材料，更优选为玻璃羊毛、玻璃膜或磁性玻璃颗 粒。此外，公开了碱性溶液用于亚硫酸氢盐处理的几种应用和包括亚硫 酸氢盐试剂、固相和碱性溶液的试剂盒。

背景技术

基因仅仅构成全部哺乳动物基因组的很小一部分，并且在占绝对优 势的非编码脱氧核糖核酸(DNA)背景的存在下对基因表达的精确控制 提出了对其进行调控的重要问题。非编码DNA包括内含子、重复元件 和潜在活跃的转座因子(transposable elements)，对于其长期沉默需要 有效的机制。哺乳动物看来是已经利用了由胞嘧啶甲基化所提供的可能 性，其给出了用于改变DNA-蛋白质的相互作用以辅助该沉默的遗传性 机制。DNA甲基化对于哺乳动物的发育是必不可少的；并且在老化和癌 症过程中发挥潜在作用。已经公认的是基因表达的调控和作为标记印记 基因的表观遗传修饰均涉及到甲基化。在哺乳动物中，甲基化仅仅发生 在胞嘧啶残基处，更具体而言，仅仅发生在毗连鸟苷残基的胞嘧啶残基 上，即在序列CG处。检测并绘制DNA甲基化位点是理解用于表征给 定的序列是否被甲基化的分子信号的必要步骤。

目前这已由Frommer，M.，等在Proc Natl Acad Sci USA 89(1992) 1827-31中描述的用于检测5-甲基-胞嘧啶的所谓亚硫酸氢盐法所完成。 绘制5-甲基胞嘧啶的亚硫酸氢盐法利用下述作用：亚硫酸氢钠与胞嘧啶 反应而不与5-甲基-胞嘧啶反应或仅仅与其有较差的反应。胞嘧啶与亚 硫酸氢盐反应以生成易于发生脱氨基作用的磺化的胞嘧啶反应中间物， 得到可在碱性条件下脱去磺酸基成为尿嘧啶的磺化尿嘧啶。公知的是尿 嘧啶具有与离析物(educt)胞嘧啶不同的胸腺嘧啶的碱基配对行为，而 5-甲基-胞嘧啶具有胞嘧啶的碱基配对行为。这使得有可能鉴别甲基化的 或非甲基化的胞嘧啶，例如通过亚硫酸氢盐基因组测序(Grigg，G.，和 Clark，S.，Bioessays 16(1994)431-6；Grigg，G.W.，DNA Seq 6(1996) 189-98)或者通过US 5,786,146中公开的甲基化特异性PCR(MSP)。

已经有多个文献涉及亚硫酸氢盐反应的特定方面(Benyajati，C.， 等，Nucleic Acids Res 8(1980)5649-67)，对5-甲基-脱氧胞嘧啶和脱 氧胞嘧啶的亚硫酸氢盐修饰进行了一般性研究(Olek，A.，等，Nucleic Acids Res 24(1996)5064-6)，公开了用于亚硫酸氢盐碱基测序的方法， 由此对嵌入琼脂糖微球中的物质实施亚硫酸氢盐处理和后续的PCR步 骤。在Clark，S.J.，等的Nucleic Acids Res 22(1994)2990-7中披露的 亚硫酸氢盐法中，样品在脱除氨基后脱盐。

Raizis，A.M.，等的Anal Biochem 226(1995)161-6公开了使模板 降解减至最小的5-甲基胞嘧啶测绘(mapping)的亚硫酸氢盐法。他们 研究了pH、温度和反应时间的影响。Grunau，C.，等的Nucleic Acids Res 29(2001)E65-5或Warnecke，P.M.，等的Methods 27(2002)101-7 也进行了类似的研究。WO 01/98528或Paulin，R.，等的Nucleic Acids Res 26(1998)5009-10公开了亚硫酸氢盐混合物中的不同的其他成分。在 WO 02/31186中公开了亚硫酸氢盐处理和PCR之后的另外的亚硫酸氢 盐步骤。Komiyama，M.，和Oshima，S.，Tetrahedron Letters 35(1994) 8185-8188研究了由亚硫酸氢盐诱导的寡聚脱氧核糖核苷酸中的胞嘧啶 脱除氨基的催化。