[发明专利]FSH突变体

说明书

技术领域

本发明涉及人类生殖领域。更具体地说，本发明涉及生育治疗。 

发明背景 

促性腺激素 

卵泡刺激素(FSH)是促性腺激素家族的一员，促性腺激素在人类生育中起着关键作用。促性腺激素，也包括黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)，是异源二聚体，每个分子由一个共有的α-亚基(92个氨基酸)和一个特有的β-亚基(FSH是111个氨基酸)组成。成熟型FSHα-亚基和β-亚基的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。 

已经从垂体和绝经后尿液中分离出人FSH(EP 322,438)并在哺乳动物细胞中重组生产(US 5,639,640、US 5,156,957、US 4,923,805、US 4,840,896、US 5,767,251、EP 211,894和EP 521,586)。后者文献中也公开了人FSHβ-亚基基因。US 5,405,945公开了一种只含有一个内含子的改构人α-亚基基因。 

Liu等人，J Biol Chem 1993，15；268(2)：21613-7，Grossmann等人，Mol Endocrinol1996 10(6)：769-79，Roth and Dias(Mol Cell Endocrinol 1995 1；109(2)：143-9，Valove等人，Endocrinology 1994；135(6)：2657-61，Yoo等人，JBiol Chem 1993 25；268(18)：13034-42)，US 5,508,261和Chappel等人，1998，Human Reproduction，13(3)：1835公开了FSH各种结构-功能关系研究，并且鉴定了参与受体结合和激活以及二聚作用的氨基酸残基。 

促性腺激素在辅助生殖技术中的应用 

促性腺激素在生殖周期中起着关键作用，在外源性治疗中使用促性腺激素对于辅助生殖技术(ART)也是必不可少的，这些辅助生殖技术例如体外授精(IVF)、IVF联合胞浆内精子注射(IVF/ICSI)和胚胎移植(ET)以及排卵诱导(OI)，OI用于进行自然体内授精或宫腔内人工授精的无排卵患者。 

US 4,589,402和US 4,845,077公开了纯化的不含LH的人FSH及其在体外授精中的应用。EP 322 438公开了一种基本上没有LH活性，具有至少6200U/mg FSH活性的蛋白，其中FSHα-亚基和β-亚基，可能分别是其野生型或截短型。 

为了获得治疗效果需要长期治疗，通常，为了刺激女性卵泡发生需要连续8-10天，有时高达21天，而对于低促性腺激素的男性，诱导精子发生需要高达18个月。重组hFSH通常是每天肌肉注射(i.m.)或皮下注射(s.c.)给药，伴生不适并可能产生局部注射部位反应。减少给药频率可促进治疗，使促性腺腺激素给药更方便、更易耐受、更为患者至上。 

FSH糖基化 

促性腺激素是糖蛋白，每个亚基含有天冬酰胺连接(N-连接)寡糖侧链，该寡糖侧链对于体内活性和功能非常重要。多肽的糖添加(糖基化)是翻译后事件，能使糖链特异性地添加到天冬酰胺(N-连接)或丝氨酸/苏氨酸(O-连接)上。和糖蛋白的蛋白部分不变的氨基酸序列相比，糖结构是可变的，这种特性称之为微异质性。例如，同一蛋白的各个N-糖基化位点可以含有不同的糖结构。而且，即便在某一蛋白的同一糖基化位点，也可能有不同的糖结构。这种异质性是糖非模板引导合成的结果。 

蛋白的N-糖基化特异性地发生在一致型模式天冬酰胺-Xaa-丝氨酸/苏氨酸(Asn-Xaa-Ser/Thr)，较少发生在一致型模式天冬酰胺-Xaa-半胱氨酸(Asn-Xaa-Cys)，其中Xaa可以是任何氨基酸残基。然而，一致型三肽的存在并不足以保证天冬酰胺残基糖基化。例如，天冬酰胺-脯氨酸-丝氨酸/苏氨酸(Asn-Pro-Ser/Thr)序列比其他一致型模式Asn-Xaa-Ser/Thr发生N-糖基化率低50倍。 

人FSH含有4个N-连接糖基化位点：2个在共有的α-亚基的52位和78位，2个在β-亚基的7位和24位。附加到FSHα-亚基的糖对于二聚体的组装、整合、分泌和信号转导非常关键，而β-亚基糖对于二聚体聚合、分泌和异源二聚体从循环中清除则非常重要。