[发明专利]处理生物学样品的方法

说明书

本发明涉及处理生物学样品的方法，通过该方法获得的生物学样品，分析所处理生物学样品的方法，处理生物学样品的装置，这些装置的应用、各种试剂盒以及组合物的应用。

长期以来，科学家关注的只是生物学样品的病理学和/或组织学研究。这些研究所用样品的保存和/或稳定通常只是将样品置于甲醛溶液中和/或包埋在石蜡中。但为了保存目的，目前长期实施的甚至是冷藏或冷冻生物学样品。

只有当认识到检测生物学样品的某些成分，例如核酸或蛋白质有极大益处，特别是在医学和临床诊断领域时，才明白需要新颖的、更有效且更经济的保存和/或稳定试剂和/或方法。

在这些发展过程中，人们认识到对于分子生物学研究至关重要的是新鲜样品中各成分的状态(基因表达或蛋白质模式)即使在将样品从其天然环境中取出后的短时间内可能会迅速改变，因此，即使将样品长期保存于未处理状态(例如由于运输到实验室期间意外延迟等所致的改变)也会使分子生物学分析不真实或者根本不可能进行随后的分析。

随着取样和样品分析之间时间流逝的增加，生物学样品的核酸状态确实会快速改变。特别是普遍存在的RNA酶导致核糖核酸(RNA)极快降解。同样，核酸降解也伴有，例如对应激基因(stress gene)的诱导，因而合成了可能极大改变样品的转录模式的新mRNA分子。因此需要立即稳定样品，从而能保留所分析基因的表达分布模式。

立即稳定样品不仅是分析核酸，也是进行详细的生物学样品中蛋白质组学研究所需，因为取样后蛋白质模式可能会立即改变。这首先是由于降解或从头合成所致，但也可能极快发生蛋白质修饰，例如磷酸化/脱磷酸化。

由于蛋白质-化学和分子生物学分析不仅用于医学和临床诊断领域，其在例如法医学、药学、食品分析、农业、环境分析和许多研究项目等其它领域的应用也日益增加，因此，保留样品的分子结构完整性和使它们立即稳定(本文中)是所有这些领域中至关重要的前提。

多年来，已开发了多种极为不同的稳定剂和/或方法来稳定各种极为不同的生物学样品。

如上所述，早已知晓借助甲醛水溶液稳定样品，随后包埋经稳定的样品以进行组织学研究。然而，在大多数情况中，这种稳定方法不适用于分子生物学方法，因为核酸获得的稳定在于非常不充分，最多只能定性检测存在的核酸或核酸片段，而不是定量检测。此外，用交联稳定剂，例如甲醛水溶液进行稳定导致组织中提取的核酸或蛋白质减少。甲醛水溶液还因毒理学原因而无法接受。

例如US 5.010,184、US 5.300,545、WO-A-02/00599和WO-A-02/00600描述了用阳离子洗涤剂等稳定剂能非常好地定性检测核酸，但只适用于含有单细胞或只含有单层细胞的样品。然而，为稳定致密组织片中的核酸，这种稳定剂不够格。

此外，为定性检测的目的而用于稳定核酸的那些试剂和方法不适用于同时稳定蛋白质。另外，以此方式稳定的样品不可用于组织学研究，因为稳定剂保存的是(例如)核酸，而不是细胞或组织结构。

包含(例如)高浓度硫酸铵的其它稳定剂(参见，例如US 6,204,375)非常适用于稳定不同组织中的核酸。然而，它们对于稳定含细胞或不含细胞的体液，例如血液、血清或血浆很不适用，它们在某些类型的组织，例如脂肪组织中的特性也不佳。

上文均表明特别难于同时稳定组织样品中的RNA、DNA和蛋白质为组织学研究保存组织样品。此外，对细胞或生物学样品的(稳定)操作不一定能应用于致密组织。与其它生物学样品相比，稳定致密组织样品中的核酸特别困难。这种组织由数层构成，并且其组成、成分和结构不均匀。为稳定致密组织样品中的核酸，稳定剂不仅必须作用于细胞表面或一层细胞，还应深入多层样品组织中。此外，在一份和同一生物学样品中，人们往往要应对类型极为不同的组织和/或细胞，它们在例如细胞结构、膜构造、区室构造和诸如蛋白质、碳水化合物和/或脂肪含量等生物分子上有所不同。

本领域已知且频繁使用的稳定组织样品(包括所有成分)的一种方法是冷冻或深冻样品。在该方法中，样品取出后立即用低于-80℃的液氮将其以天然环境冷冻。如此处理的样品实际上可无限期地保存在约-70℃，其完整性不会发生任何变化。然而，所有这些方法需要非常复杂的后勤要求，因为在运输、保存期间或者各种目的和应用期间必须防止样品解冻。此外，特制的样品容器和永久冷却样品增加了费用，应用液氮不仅非常复杂，而且要特别小心地操作。