[发明专利]利用以RNA病毒或DNA病毒的刺突蛋白质假型化的慢病毒载体将基因导入呼吸道上皮干细胞

说明书

技术领域

本发明涉及一种将基因导入呼吸道上皮干细胞的慢病毒载体，该载体用RNA病毒或DNA病毒的刺突蛋白质假型化。

背景技术

囊性纤维症(Cystic Fibrosis：CF)是白种人中最常见的致死性常染色体隐性疾病，此病的原因由囊性纤维症跨膜转导调节因子(CFtransmembrane conductance regulator：CFTR)基因发生异变引起，由于离子不能跨越呼吸道上皮移动，使粘膜增厚，细菌附着，最终导致发病。因此，呼吸道上皮细胞成为基因治疗的重要靶的。

为使导入基因得以长期表达，重要的是要将基因导入到包括干细胞在内的呼吸道上皮细胞前体细胞。所谓干细胞是指具有多分化功能和自我复制能力的未分化细胞。呼吸道的干细胞存在于粘液下腺组织(sub-mucosalgland)的导管上皮(ductal epitherium)周围，或基底膜(basement membrane)的基底细胞(basal cells)周围，气管上皮及基底细胞可以阻断外部毒素及有害物的侵入(参考非专利文献1及2)。另外，有报告说，该细胞也散在于小鼠气管的软骨组织中(参考非专利文献1)。一般来说，上皮细胞的干细胞非常少，存在于粘液下腺组织(sub-mucosal gland)中被隔离的部位，基因导入等方案很困难。包括干细胞在内的呼吸道上皮细胞，由于存在粘蛋白层及粘液，是难以基因导入的组织。

呼吸道上皮细胞具有极性，将接触外部空气侧称之为顶侧(apical side)、体腔侧称之为基底外侧(basolateral side)。由于呼吸道上皮细胞的顶侧表面没有病毒受体，几乎没有载体可以有效转导到无伤的呼吸道上皮中。以腺病毒为首，很多病毒受体在基底外侧，EGTA及表面活性剂等前处理(pre-conditioning)要在临基因导入前进行。水疱性口内炎病毒糖蛋白质(VSV-G)假型化慢病毒载体，例如，为有效转导必须用洗涤剂将上皮表面做前处理。但这些化学处理不可临床应用。

囊性纤维症等呼吸系统障害性遗传疾病中已开发出了基因治疗载体及给药方法。为将基因导入呼吸道上皮细胞，需要通过粘蛋白层及粘液由上皮细胞顶侧进行导入。对于从基底外侧感染的病毒载体，存在于上皮细胞之间的紧密连接阻碍了这些载体的进入。因此，采取钙络合剂EGTA，或其与各种表面活性剂并用的给药方法，打破紧密连接。然而在人体临床上，这种方法(pre-conditioning)还是不被看好。

一般用于假型化的VSV-G受体位于呼吸道上皮细胞基底外侧，所以基因导入时需要用溶血磷脂胆碱(LPC；表面活性剂的一种)进行处理。LPC处理后将VSV-G假型化HIV载体(搭载基因；LacZ)感染到小鼠鼻腔，导入基因的表达至少持续了92天(参照非专利文献3)。这个结果启示我们因为上皮细胞的寿命为3个月，所以基因导入干细胞是可能的。没有前处理的慢病毒载体的假型化，有报告举为，埃博拉病毒·扎伊尔株的包膜蛋白质(参照非专利文献4)。并且在小鼠呼吸道组织中观察到了搭载LacZ基因可持续表达63天。虽然该实验的实施期间没有达到上皮细胞的寿命，但仍能确认基因导入到了据说有干细胞存在的粘膜下腺中。

另外还有以下公开的文献。

【非专利文献1】Borthwick等著、Am J.Respir.Cell Mol.Biol.、Vol.24、pp662-670、2001年

【非专利文献2】Engelhardt著、Am J.Respir.Cell Mol.Biol.、Vol.24、pp649-652、2001年

【非专利文献3】Limberis等著、Human Gene Therapy、Vol.13、pp1961-1970、2002年

【非专利文献4】Kobinger等著、Nature Biotechnology、Vol.19、pp225-230、2001年

【非专利文献5】Alberto Auricchio等著、The Journal of ClinicalInvestigation、Vol.110、Number 4、pp.499-504、2002年

【非专利文献6】John F.Engelhardt著、The Journal of ClinicalInvestigation、Vol.110、Number 4、pp.429-432、2002年

发明内容

【本发明要解决的课题】