[发明专利]将融合多肽递送入细胞的方法

说明书

发明背景

技术领域

本发明涉及将生物分子转导复合物(BTC)诸如融合多肽递送入细胞的 方法。所述生物分子转导复合物(BTC)包含蛋白转导结构域(PTD)和目的 分子，诸如多肽。

背景技术

通常，大分子诸如蛋白和核酸不能透过活细胞。仅仅小分子可以非常 低的速率透过活细胞膜限制了开发利用大分子诸如蛋白和核酸来治疗、预 防或诊断疾病的药物的研究。因此，将生物活性大分子有效转导入活细胞 的细胞液和细胞核而不会造成有害的副作用的方法是非常需要的。

蛋白转导结构域(PTDs)已经被用于递送生物活性分子(Viehl C.T.，et al.， Ann.Surg.Oncol.12：517-525(2005)；Noguchi H.，et al.，Nat.Med.10：305-309 (2004)；和Fu A.L.，et al.，Neurosci.Lett.368：258-62(2004))。但是没有试图利 用PTD递送受体蛋白的胞质结构域。也没有试图经鼻内递送载有生物活性 分子的PTD。

CTLA-4(细胞毒T淋巴细胞抗原-4)是的活化诱导的T细胞表面分子， 对于T细胞活化的负调控是必需的。其结合抗原呈递细胞(APC)上的B7-1 或-2，其亲和力高于T细胞活化的正辅助性刺激分子CD28的亲和力10-到 20-倍(Ngoc L.P.，et al.，Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.5：161-166(2005)； Noel P.J.，et al.，Adv.Exp.Med.Biol.406：209-217(1996)；和Perkins D.，et al.， J.Immunol.156：4154-4159(1996))。

发现含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的CTLA-4胞质结构域在不 同物种之间100％保守，提示该区域对于CTLA-4通过螯合细胞内信号分子 对T细胞活化进行负调控是重要的(Ravetch，J.V.&Lanier，L.L.，Science 290：84-89(2000)；和Jay，C.U.&Jie，J.，Curr.Opin.Immunol.9：338-343 (1997))。因此，CTLA-4的胞质结构域是开发哮喘、自身免疫性疾病以及 移植物排斥的免疫治疗药物而言非常好的细胞靶。目前，利用PTD将受体 蛋白具体是CTLA-4递送进入细胞是困难的。我们现在已经显示通过将仅 仅受体蛋白的胞质结构域与PTD融合来递送CTLA-4作为PTD货物(cargo) 的方法。CTLA-4的胞质结构域对于活化的T细胞是特异性的，所以在用 作PTD的货物蛋白时，其克服了阳离子PTD组织特异性的缺乏导致的其 体内应用的限制。

发明简述

本发明的一个目的是提供抑制患有自身免疫性疾病或炎性疾病的脊椎 动物中的T细胞活化的方法，包括给药所述脊椎动物治疗有效量的包含蛋 白转导结构域和受体蛋白的胞质结构域的融合多肽。

本发明的另一目的是提供将生物分子转导复合物(BTC)递送给气管或 肺细胞的方法，包括经鼻内给药生物分子转导复合物到脊椎动物。生物分 子转导复合物包含蛋白转导结构域(PTD)和目的分子。

另一优选实施方案是利用特异于活化T细胞的CTLA-4胞质结构域 (SEQ ID NO：11)作为PTD的货物蛋白。利用PTD-ctCTLA-4融合蛋白克服 了由于阳离子PTD的组织特异性缺乏导致的其体内应用的限制。

本发明使得能够开发新的治疗蛋白药剂，其包含具体蛋白的蛋白转导 结构域，诸如Hph-1，其具有高度细胞或组织特异性。本发明还使得能够经 由局部给药途径给药产生的融合多肽，从而最小化或避免系统副作用，诸 如行为异常，细胞毒性和免疫原性。

附图简述

图1A显示Hph-1-PTDβ-gal或eGFP缀合的融合蛋白的结构。Hph-1- PTD是11个氨基酸的蛋白转导结构域(YARVRRRGPRR)(SEQ ID NO：1)， 从人转录因子Hph-1鉴定。

图1B是通过Western印迹分析的培养的Jurkat(E6.1)细胞中Mph-1- β-gal的转导活性和动力学的照片。