[发明专利]用于基于AFLP的高通量多态性检测的方法

权利要求书

1.高通量发现、检测和基因分型多个样品中一种或多种遗传标记的方法，包 括下述步骤：

a)提供来自多个样品的DNA；

b)用至少一种限制性内切酶限制DNA以产生限制性片段；

c)连接标记的接头与限制性片段，产生标记的接头-连接的限制性片段；

d)用引物对扩增标记的接头-连接的限制性片段，其中至少一个引物对接头的 至少部分互补，产生针对每个样品的扩增的标记的接头-连接的限制性片段的文库；

e)使用高通量测序技术测序文库；

f)使用标识符标记鉴定文库内和/或文库之间的遗传标记；

g)测定文库中遗传标记的共-显性基因型，

其中所述方法不用于人类和动物疾病的诊断。

2.根据权利要求1所述的方法，其中遗传标记为AFLP标记或SNP标记。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中测序是基于合成的测序。

4.根据权利要求1所述的方法，其中测序在固体载体如珠粒上进行。

5.根据权利要求1所述的方法，其中测序包括下述步骤：

-退火扩增的接头-连接的限制性片段至珠粒，每个珠粒同单个接头-连接的 片段退火；

-在油包水型微型反应器中乳化珠粒；每个油包水型微型反应器包括单个珠 粒；

-进行乳剂PCR以在珠粒表面上扩增接头-连接的限制性片段；

-将珠粒装填在池中，每个池包括单个珠粒；和

-产生焦磷酸盐信号。

6.根据权利要求1所述的方法，其中标记的扩增的接头-连接的限制性片段的 平均冗余度为至少6。

7.根据权利要求1所述的方法，其中测定每个接头-连接的限制性片段的序列 至少6倍。

8.根据权利要求1所述的方法，其中在内切核苷酸酶限制和接头连接之间， 通过变性步骤进行大小选择。

9.根据权利要求1所述的方法，其中DNA选自cDNA、BACs、YACs、包括 整体基因组扩增的DNA或PCR产物的基因组DNA。

10.根据权利要求1所述的方法，其中接头为双链的合成寡核苷酸接头，其 具有一个适合于限制性片段的一个末端或两个末端的末端。

11.根据权利要求1所述的方法，其中DNA被两个、三个或更多个限制性内 切酶限制。

12.根据权利要求1所述的方法，其中DNA被两个限制性内切酶限制。

13.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个限制性内切酶是低频切割酶。

14.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个限制性内切酶为高频切割酶。

15.根据权利要求1所述的方法，其中引物包含1至10个选择性核苷酸。

16.根据权利要求1所述的方法，其中使用三个或更多个限制性内切酶的组 合限制DNA。

17.如上述权利要求任一项所定义的方法用于AFLP和/或SNP标记序列的共 -显性评分的用途。