[发明专利]用于评估HIV病毒适应度的方法、质粒载体和引物

权利要求书

1.一种用于测定两种HIV病毒在环境中的复制能力的离体或体外 方法，所述方法包括下述步骤：

e)产生标签化的重组传染性病毒，其包含标签化的HIV DNA载体 和来自第一目标HIV病毒的第一扩增子；其中所述标签化的HIV DNA 载体通过在选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr和vpu的HIV 基因之一中导入一个或多个沉默突变来产生；其中所述标签化的HIV DNA载体在其DNA序列中具有删除，所述删除最多对应于或重叠于来 自所述第一目标HIV病毒的所述第一扩增子的侧翼区域；其中所述一个 或多个沉默突变被导入下述基因中，所述基因不被来自所述第一目标 HIV病毒的所述第一扩增子包括；以及其中所述第一扩增子包含来自所 述第一目标HIV病毒的gag、pol或env基因；

f)产生未标签化的重组传染性病毒，其包含未标签化的HIV DNA 载体和来自第二目标HIV病毒的第二扩增子；其中所述未标签化的HIV  DNA载体不包含在步骤e)的标签化的HIV DNA载体中导入的一个或 多个沉默突变；其中所述未标签化的HIV DNA载体在其DNA序列中具 有删除，所述删除最多对应于或重叠于来自所述第二目标HIV病毒的所 述第二扩增子的侧翼区域；以及其中所述第二扩增子包含来自第二目标 HIV病毒的gag、pol或env基因；

g)在给定环境中在细胞培养物中混合步骤e)和f)的重组传染性 病毒；以及

h)通过检测所述标签化的重组传染性病毒的所述HIV DNA载体部 分中的一个或多个沉默突变，和通过检测所述未标签化的重组传染性病 毒的所述HIV DNA载体部分中一个或多个沉默突变的缺乏，通过定量 扩增测定总病毒群体内标签化的重组传染性病毒的比例和未标签化的 重组传染性病毒的比例。

2.一种用于测定三或更多种HIV病毒在环境中的复制能力的离体 或体外方法，所述方法包括下述步骤：

a)产生权利要求1中步骤e)的标签化的重组传染性病毒；

b)产生权利要求1中步骤f)的未标签化的重组传染性病毒；

c)产生其它的一种或多种标签化的重组传染性病毒，每种包含标 签化的HIV DNA载体和来自其它一种或多种目标HIV病毒的第三种或 后续的扩增子；其中通过在选自gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr 和vpu的HIV基因之一中导入一个或多个沉默突变来产生所述标签化的 HIV DNA载体，所述一个或多个沉默突变不同于这个权利要求的步骤a) 的所述第一标签化的HIV DNA载体的一个或多个沉默突变；其中每种 所述标签化的HIV DNA载体在其DNA序列中具有删除，所述删除最多 对应于或重叠于来自所述第三或后续的目标HIV病毒的所述第三或后 续的扩增子的侧翼区域；其中所述一个或多个沉默突变被导入下述基因 中，所述基因不被来自所述第三或后续的目标HIV病毒的所述第三或后 续的扩增子包括；以及其中所述第三或后续的扩增子包含来自所述第三 或后续的目标HIV病毒的gag、pol或env基因；

d)在给定的环境中在细胞培养物中混合步骤c)的重组传染性病毒 和步骤a)和b)的重组传染性病毒；以及

e)通过检测每种所述标签化的重组传染性病毒的所述HIV DNA载 体部分中的一个或多个沉默突变，和通过检测所述未标签化的重组传染 性病毒的所述HIV DNA载体部分中一个或多个沉默突变的缺乏，通过 定量扩增测定总病毒群体内每种标签化的重组传染性病毒的比例和未 标签化的重组传染性病毒的比例。

3.根据权利要求1-2的任一项的方法，其中所述扩增通过聚合酶链 式反应(PCR)、链交换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、基 于核酸序列的扩增(NASBA)、自持的序列复制(3SR)、基于转录的 扩增(TAS)、滚环扩增(RCA)、环介导的等温扩增(LAMP)或连 接酶链式反应(LCR)进行。