[发明专利]融合蛋白文库的产生和筛选方法及其应用

权利要求书

1.一种制备重组细胞文库的方法，其中每个重组细胞包括编码融合蛋 白的核酸序列，其包括如下步骤：

(a)构建载体文库，其中每个载体编码融合蛋白并且包含1)核酸序 列，其编码结合到靶分子的配体蛋白所述靶分子连接到2)编码效应分子 的核酸序列；以及

(b)用载体文库转化宿主细胞以产生重组细胞文库。

2.根据权利要求1所述的制备重组细胞文库的方法，其中每个重组细 胞表达免疫毒素，其包括如下步骤：

(a)构建载体文库，其中每个载体含有一个轻链可变区核酸序列和/或 一个重链可变区核酸序列，且其中轻链可变区核酸序列或重链可变区核酸 序列可正常运转地连接到编码细胞毒素的核酸序列上；以及

(b)用载体文库转化宿主细胞以产生重组细胞文库。

3.根据权利要求2所述的方法，其中轻链可变区和重链可变区从B细 胞中分离。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述B细胞是成熟的B细胞。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述B细胞来自患有癌症的 受试者。

6.根据权利要求2到5中任一项所述的方法，其中所述细胞毒素是核 糖体失活多肽。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞毒素选自多花白树毒蛋 白、bouganin、皂草毒蛋白、蓖麻毒蛋白、蓖麻蛋白A链、异株泻根毒蛋 白、白喉、局限毒素(restrictocin)、假单胞菌外毒素A及它们的变异体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞毒素是改性的bouganin 或其变异体。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞毒素是假单胞菌外毒素 A的变异体，其没有功能性细胞结合域。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞毒素是假单胞菌外 毒素A的截短形式，其由氨基酸252-608或其变异体和内质网保留序列组 成。

11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞 为大肠杆菌。

12.重组细胞文库，其中每个重组细胞表达融合蛋白，根据权利要 求1到11中任何一项所述的方法制备。

13.制备融合蛋白文库的方法，包括：

(a)制备根据权利要求1～10中任何一项所述的重组细胞文库；

(b)克隆所述的重组细胞；以及

(c)表达融合蛋白文库，其中所述融合蛋白是所述重组细胞表达的可 溶蛋白。

14.根据权利要求13所述的方法制备的融合蛋白文库。

15.免疫毒素文库，其包括多个重链可变区和多个轻链可变区，并 且其中文库中的每个免疫毒素具有一个重链可变区和一个轻链可变区，且 所述轻链可变区或所述重链可变区与细胞毒素相连。

16.根据权利要求15所述的文库，其中所述细胞毒素是核糖体失活 多肽。

17.根据权利要求16所述的文库，其中所述细胞毒素选自多花白树 毒蛋白、bouganin、皂草毒蛋白、蓖麻毒蛋白、蓖麻蛋白A链、异株泻根 毒蛋白、白喉、局限毒素、假单胞菌外毒素A及它们的变异体。

18.根据权利要求17所述的文库，其中所述细胞毒素是改性的 bouganin或其变异体。

19.根据权利要求17所述的文库，其中所述细胞毒素是假单胞杆菌 外毒素A，其没有功能性细胞结合域。

20.根据权利要求19所述的文库，其中所述细胞毒素是假单胞菌外 毒素A的截短形式，其由氨基酸252-608或其变异体和内质网保留序列组 成。

21.根据权利要求15到20中任一项所述的文库，其中所述轻链可 变区和重链可变区从B细胞中分离。