[发明专利]新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其编码基因和生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶、编码该酶的基因、生产 该酶的微生物和该酶的生产方法。

背景技术

糖转移酶是与生物体内的糖蛋白、糖脂等(以下称复合糖)的糖链的 生物合成相关的酶。其反应生成物即复合糖的糖链在生物体内具有非常重 要的功能。例如，已知糖链是一种重要的分子，其主要在哺乳动物细胞中 作为处于分化、发育的细胞间及细胞-细胞外基质信号传导、复合糖的靶标 而发挥作用。

其应用例为血液中生产红血球的激素促红细胞生成素。天然的促红细 胞生成素存在效果持续性差的缺点。因此，促红细胞生成素是一种糖蛋白， 通过附加新的糖链开发了可延长生物体寿命的重组促红细胞生成素蛋白， 并生产且实现了商品化。今后，此类附加或改变糖链的医药品、功能性食 品等的开发也会越来越多。因此，寻求开发一种可任意合成/生产糖链的方 法。其中，一种最有效的方法是糖转移酶的开发，其重要性越来越明显。

至今为止，已经从人、小鼠、大鼠和酵母等真核生物中分离出约150 种以上的糖转移酶基因。并已进一步在CHO细胞、大肠杆菌等宿主细胞中 发现了该基因，且生产出具有糖转移酶活性的蛋白质。另一方面，从原核 生物细菌中也分离出20～30种糖转移酶基因，并已进一步在使用大肠杆菌 的重组生产系统中表达具有糖转移酶活性的蛋白质，还阐明了其底物特性、 各种酶化学性质。

由于唾液酸多存在于糖链的非还原末端，对于糖链功能的表达，是极 为重要的糖。于是，在糖转移酶中，唾液酸转移酶是最重要且高活性酶的 一种。关于β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其基因，有很多动物，特别是 哺乳类动物来源的报道(Hamamoto，T.等，Bioorg.Med.Chem.，1， 141-145(1993)；Weinstein，J.等.，J.Biol.Chem.，262，17735-17743(1987))。但 由于这些动物来源的酶很难纯化，不能大量获得，价格很高，而且存在酶 稳定性差的问题。另一方面，有唯一一篇报导称已从属于美人鱼发光杆菌 (Photobacterium damselae)的微生物中获得了微生物来源的β-半乳糖苷 -α2，6-唾液酸转移酶及其基因(国际公开第WO98/38315号；美国专利 6255094号公报)。

但由美人鱼发光杆菌生产发光杆菌属来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转 移酶的生产性为550U/L(Yamamoto，T.，等.，Biosci.Biotechnol.Biochem.， 62(2)，210-214(1998))，利用含有该基因的质粒pEBST△178通过重组大肠 杆菌生产β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的生产性为224.5U/L(Yamamoto， T.，等.，J.Biochem.，123，94-100(1998))，目前需要一种具有更高生产性的 酶。此外，美人鱼发光杆菌来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶的比活性 为5.5U/mg(Yamamoto，T.等.，J.Biochem.，120，104-110(1996))，从这 个角度考虑更需要寻找一种活性更高的酶。

另外，酶的种类很多，在公知的微生物来源的唾液酸转移酶中，生产 性和活性较高的例子为出血败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)来源的 α2，3-唾液酸转移酶，其生产性为6,000U/L(Yu，H.，等.，J.Am.Chem.Soc.， 127，17618-17619(2005))，比活性为60U/mg。

出于对唾液酸转移酶的高需求，更需要一种高生产性和/或活性高的β- 半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶。

专利文献1：国际公开第WO98/38315号小册子

专利文献2：美国专利6255094号公报

非专利文献1：Hamamoto，T.等，Bioorg.Med.Chem.，1，141-145(1993)

非专利文献2：Weinstein，J.等.，J.Biol.Chem.，262，17735-17743(1987)

非专利文献3：Yamamoto，T.等.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(2)， 210-214(1998)