[发明专利]利用毕赤酵母分泌表达一种HPV16型治疗性重组蛋白疫苗

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用毕赤酵母分泌表达HPV无佐剂治疗性蛋白疫苗的新型工艺方法。

技术背景：

本发明研制的疫苗，其HPV16来源为本科室自我国山西宫颈癌高发区分离得到的HPV16常见亚型：HPV16z，从HPV16z毒株中克隆出E6和E7基因片段用于构建疫苗，对我国的HPV16将具有较高的针对性。

目前在研的HPV治疗性疫苗多为原核表达，Hsp65-HPV16zE6E7融合蛋白疫苗也不例外，在原核表达系统中以包涵体的形式表达，下游的复性存在诸多问题，如成本较高和热源等，而真核表达系统与其相比具有明显优势，如表达量高，可溶表达，糖基化接近等。酵母是单细胞低等真核生物，其既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性，同时又具有适合真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统。重组的外源蛋白融合不同的信号序列后，酵母还可以将外源蛋白分泌至培养基中，有利于下游的纯化。

发明内容：

本发明涉及融合蛋白的毕赤酵母表达菌的构建。本发明的Hsp65-HPV16z E6/E7融合基因，其HPV16zE6/E7片段包括E63’端264个碱基和经修饰E7完整片段，E7基因编码第24位的半胱氨酸和第26位的谷氨酸的密码子定点突变成甘氨酸密码子，使其丧失导致抑癌基因失活能力，同时E7的58和91位密码子同时突变，其编码的氨基酸由半胱氨酸突变成甘氨酸，降低E7蛋白稳定性，免疫呈递效果更佳，本发明的Hsp65为牛结核杆菌来源的热休克蛋白65(Hsp65)，本发明的融合基因Hsp65-HPV16zE6E7可以通过设计引物从原核表达载体PET28a-Hsp65-HPV16zE6E7(CN2005100854614)中克隆获得，插入到酵母表达载体中，本发明优选pPIC9K，将构建正确的表达载体转化毕赤酵母，获得正确表达的菌株，本发明优选通过大量筛选G418抗性高的克隆菌株，获得稳定高表达Hsp65-HPV16zE6E7的基因工程酵母。

附图说明：

图1：酵母表达质粒Ppic9K-Hsp65-HPV16zE6E7的构建

图2：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析融合蛋白的表达

具体实施方式：

实施例一  Hsp65-E6/E7融合蛋白表达质粒和菌株的构建

以质粒PET28a-Hsp65-HPV16zE6E7为模板，设计2段引物，P1：GAAAA GAGCCAAGACAATTGCGTACGAC，P2：GCTCGAATTCTTATCATGGTTTCTG AGAACAGATGG，反应条件为：94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，30个循环。琼脂糖凝胶电泳回收并使用EcoRI酶切PCR产物，产物再次琼脂糖凝胶电泳回收备用。pPIC9质粒经Xho I单酶切后，T4DNA聚合酶补平粘末端，经纯化后用EcoR I单酶切，将酶切后质粒和外源片段16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒进行酶切鉴定，将鉴定正确的Ppic9-Hsp65-HPV16zE6E7质粒和Ppic9K质粒使用Bpu1102I和EcoR I双酶切，分别回收前者的小片段和后者的大片段进行连接，条件同上，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒进行酶切鉴定，将鉴定正确的质粒和菌株保种。大提质粒进行BglII酶切，乙醇沉淀回收线性片段，将50ugDNA样品溶解于不多于20ul总体积。将样品直接加入到冻存的感受态管中(PEG1000法制备)，按照INVITROGEN公司的PROTOCAL转化酵母细胞，最终酵母菌30℃MD平板孵育3-4天，直至长出菌斑。

实施例二  Hsp65-E6/E7融合蛋白高菌株的筛选和表达

为筛选含多拷贝目的基因的酵母菌株，我们采用以下步骤：

1)取一96孔板名A，在每个孔中加入200ulYPD；

2)分别挑取MD平板上酵母克隆，转至A板每个孔中；

3)放置于30度温箱内培养2天；

4)取出A板，轻微震荡混匀细胞，另取一无菌96孔板B，且每孔中加入190ulYPD；

5)从A板的每孔中取出10ul，加入到对应的B板的孔中；

6)将B板置入30度温箱内培养1天；

7)2天后，取出B板，重复步聚5和6，将细菌传到C板；

8)取出C板，重悬并吹打每个孔内的细胞；

9)按一定的顺序，每个孔分别取2ul点样画有格栅的含G418的平板中，G418的浓度分别为0，，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0mg/ml；

10)30度孵育，分别2，3，4，5日检测G418平板中菌落的生长情况；从4.0mg/ml G418平板中挑取阳性单克隆，于100mlBMGY培养基中，30℃振荡培养，直至OD值达到约2-6，3000g室温离心10分钟收集细胞，弃上清，使用20ml BMMY重悬细胞，30℃振荡继续培养。每24小时加入甲醇至终浓度为0.5％。96小时后离心收集上清，进行SDS-PAGE蛋白电泳同时蛋白银染。通过灰度测定，比较蛋白表达水平，筛选出高表达菌株。