[发明专利]核酸三联探针和核酸四联探针

说明书

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体地说是在核酸的分子杂交检测中，应用本发明的核酸三联探针或核酸四联探针，通过分子杂交，使核酸三联探针或核酸四联探针间形成网络状的探针聚合体，和磁珠连接的捕获探针在与靶序列和探针聚合体杂交时，使用常规荧光染料染色，可方便地定量或半定量确定靶序列含量。采用本发明技术检测靶序列，检测的敏感度可以达到10拷贝靶序列水平。

技术背景

在生物学，医学临床微生物，环境微生物和遗传病研究中，以及法医学和环境科学等研究中，核酸检测是常用的技术手段，由于具有高特异性，高灵敏度和可靠性，核酸检测不仅应用在理论研究中，也应用于临床致病微生物和遗传病的病因分析与检测。

分子杂交技术虽然在敏感度方面比酶扩增反应低一些，但是这种特性也使分子杂交同时具备了一种优点，在临床上进行检测时，对样品处理过程中的气溶胶污染不敏感，同时RNA和DNA检测处理上完全一样，提高分子杂交技术的检测敏感度，对于临床应用分子检测技术，具有实际应用价值。

核酸分子杂交在临床应用早期主要是斑点杂交，但过程比较复杂。目前国外已出现了商品化的三明治杂交试剂盒，利用连接在基质上(酶标板孔内)的捕获探针，与靶序列杂交后，使靶序列通过捕获探针连接在基质上，同时标记探针在靶序列的其他位置上杂交，因此杂交的特异性更强，操作也更简便，与免疫试剂操作类似。但该方法的是一种固液相的杂交，杂交效率会有一定影响，也很难进行自动化检测。与三明治杂交类似的方法，是应用磁珠连接的捕获探针，被检模板靶核酸和标记探针三者在液相中进行杂交，杂交的效率高，操作简便。随着相关技术研究的进展，应用磁珠的核酸提取的自动化设备已有商品出售，应用磁珠的核酸分子杂交自动化设备国内外也都有相关专利报道，随着分子杂交技术的研究进展，便捷的应用磁珠的自动化杂交设备的出现也是可预期的。

核酸分子杂交检测的敏感度，与探针的设计和标记检测方法有关。在非同位素标记检测中，其中敏感度较高的DNA分支探针(美国专利US5614362)，是通过在探针上连接树枝状的标记的相关结构，进一步通过增加连接酶标抗体数量达到增强反应显示。树枝状的标记结构，是经化学合成后连接有单链核酸序列，形成带有树枝状分枝的探针。日本学者发明的二联探针，通过两个探针间的互补核酸片段正链或负链碱基配对，形成探针聚合体，使检测的敏感度提高到单拷贝的程度(中国专利公开号CN 1484697，中国专利公开号CN 1364199A，美国专利US 6261846)。二联探针互补配对形成的聚合体，与化学合成的树枝状标记结构比较，设计和制备更简单，敏感度也更高，达到单拷贝靶序列的检测水平。

本发明设计的探针，使不同核酸串联探针间的端部与中部互补核酸片断配对，形成三联和四联探针。两个不同的三联探针间的互补单链分支核酸片断配对，可以形成网络状探针聚合体结构。+字型的四联核酸探针间单链分支的互补核酸片段正链或负链碱基配对，也可以形成网络状探针聚合体结构，核酸四联探针的空间构型中，其四个单链分支端部应位于正四面体的四个角部位，构成的探针聚合体是立体的三维网络结构。立体的三维网络结构的探针聚合体外侧是未配对的单链分支，因此四联核酸探针聚合体与靶序列碱基互补配对连接的效率更高。构成核酸四联探针的四个核酸串联探针中，相邻的两个核酸串联探针含有连锁的靶序列核酸片段正链或负链(每个靶序列分成两个连锁的核酸片段)，在核酸四联探针与靶序列杂交时，将有两个相邻的核酸串联探针共同与靶序列互补配对，同时两个核酸串联探针间的互补核酸片段正链或负链碱基配对，使核酸串联探针与靶序列的杂交温度提高，错配的可能性减低而杂交的可靠性更强。应用磁珠连接捕获探针，与靶序列和核酸四联探针杂交，通过荧光染料染色或酶标显色可以检测出单拷贝靶序列。

发明内容