[发明专利]恩罗氟沙星的单株抗体及其检测套组

说明书

技术领域

本发明关于一种对恩罗氟沙星(Enrofloxacin)具有专一性的单株抗体，分泌生产该单株抗体的融合瘤细胞株，含此单株抗体的套组，以及利用该单株抗体检测恩罗氟沙星残留的方法。

背景技术

恩罗氟沙星(Enrofloxacin，ENR)，又名恩氟奎林羧酸，属于氟奎诺酮类(fluoroquinolone)抗生素的一种，是一种广效型抑菌剂，藉由阻断细菌DNA旋转酶(gyrase)的α单元，以抑制DNA的复制。由于DNA旋转酶属于拓朴异构酶(topoisomerases)的酵素，该酵素是负责DNA链的超螺旋结构(supercoiling)的解离，因此，恩罗氟沙星能让DNA的双股无法解离，进而抑制DNA的合成。藉由恩罗氟沙星的特殊作用机制，可有效抑制革兰氏阳性菌、阴性菌、布氏菌、披衣菌及霉浆体等。

恩罗氟沙星和其同类的抗生素早期普遍合法用于鸡和牛只的身上，后来因过度滥用而导致家禽传染的病菌，如常见的造成食物中毒的弯曲杆菌属(campylobacter)，会对氟奎诺酮产生抗药性，这些产生抗药性的弯曲杆菌繁殖于家禽的消化道内，经过运输和屠宰而散布出去；近日更是在许多国家养殖鳗鱼的进出口中，被检测出有恩罗氟沙星的残留。由于，恩罗氟沙星在动物体内的残留期相当长，若肉类食品中残留恩罗氟沙星，势必会对人体的健康造成危害，其副作用包含肠道阻塞、高致敏感性反应及结晶尿等。因此，国际趋势-使用于人体的抑菌剂应避免使用于畜禽动物饲养上，以免因用药残留而衍生出细菌产生抗药性等问题。目前在许多国家都已下令禁用此类抗生素，依中国台湾《水产动物用药品使用规范》，恩罗氟沙星用于动物(例牛、猪)，而不得使用于水产动物(包含鳗鱼、吴郭鱼、香鱼、虹鳟、黑鲷、黄鳍鲷、虱目鱼、草虾及斑节虾等九种)中，又依中国台湾《动物用药残留标准》，水产品中不得检测出有恩罗氟沙星残留。

目前，针对恩罗氟沙星的检测方法，主要可分为三大类：测试片试剂快速检验法(thin-layer chromatography，TLC)、酵素结合免疫吸附分析法(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)、高效能液相层析法(high performance liquid chromatography，HPLC)。

1.测试片试剂快速检验法：其基本原理是利用抗原(antigen，Ag)和抗体(antibody，Ab)的特异性免疫化学反应进行分析。整个反应机制是先让样品检液和反应微孔中的抗体-胶体金结合体发生竞争反应，再利用测试片(下端被覆白色玻璃纤维)的毛细现象展开后，于中央判读区进行是否有恩罗氟沙星残留情形的判读。此测试片试剂套组对恩罗氟沙星的检测具有特异性，其检测感度达15ppb。

2.酵素结合免疫吸附分析法：ELISA的原理同样是利用抗原与抗体结合的专一性，加上酵素的呈色(或产生荧光)反应，来显示特定蛋白质是否存在。利用竞争酵素结合免疫吸附分析法，可以做水产、畜禽、肉品、蛋品及乳品中恩罗氟沙星残留的定性筛检及定量分析。以目前市售Euro-Diagnostica B.V.(荷兰)的产品-恩罗氟沙星酵素结合免疫吸附分析套组为例说明，分析10件样品仅需2小时(包含试剂反应培养时间1.5小时)，其检测感度为3ppb。

3.高效能液相层析法：于本方法中，检体先经由萃取、净化的前处理步骤制得一分析检液后，参考CNS-14684食品中动物用药残留检验方法-诺氟奎琳羧酸、大安氟奎琳羧酸、恩氟奎琳羧酸的检验及食品中动物用药残留量检验方法-奎诺酮类多重残留分析法，利用高效能液相层析仪并配合光二极管列阵检出器(photodiode array detector)及荧光检测器(fluorescene detector)串联使用，可作为畜禽肉及水产品中恩罗氟沙星残留的定性确认及定量分析。该检测方法的检测感度为20ppb。