[发明专利]小鼠间充质干细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及间充质干细胞的分离培养方法。尤其是涉及小鼠的间充质 干细胞培养方法。

背景技术

间充质干细胞除具有长期自我更新和多向分化的潜能，还有免疫原性 低，被认为是细胞治疗和基因治疗的合适的细胞源。由于小鼠维持费 用低及它的基因分析很清楚，故当前用于细胞治疗和基因治疗的动物 模型一般是小鼠。

因间充质干细胞的贴壁的特性，在人、狒狒、兔、大鼠等其它动物的 骨髓中都能成功分离出间充质干细胞，而小鼠间充质干细胞在分离培 养中因非间充质细胞的污染使其远比人和其它物种难以分离，代传困 难。在国内，暂无人系统详实的陈述小鼠间充质干细胞的分离方法。 最近几年，虽有几篇文献介绍小鼠间充质干细胞的培养方法，但国内 的研究机构并未成功的分离培养出来。

发明内容及具体实施方案

材料和推荐试剂：

·DMEM-LG                            ·有盖培养皿或小瓶子

·HEPES                              ·6-孔培养板

·FBS                                ·15ml离心管

·外科材料(适当大小的剪子，镊子等)   ·血细胞计数器

·带有22G针头的5ml注射器             ·0.3％台盼蓝(溶于PBS)

培养基

基础培养基是DMEM-LG含3.7g/l的碳酸氢钠各种0-15mM HEPES。完全 培养基含10％FBS的基础培养基。

原代培养

步骤：

1.用颈椎脱臼法杀死小鼠

2.放入70％的酒精中3分钟左右，再转到操净台上

3.移去附着在股骨、胫骨上的连接组织(用无菌的剪刀和镊子)

4.用含有完全培养基的注射器将针头插入骨的一端并将另一头的骨 端剪去，也可将两端剪去，冲洗骨髓到皿中

5.来回冲洗最多五次后，将骨弃去

6.转移细胞悬液到15ml的离心管中，离心300-400g，10分钟

7.在6ml的完全培养基中重悬细胞。

8.取少量与台盼蓝1∶1混合，用计数板计算细胞数

9.再离心收集细胞，以适当的完全培养基重悬细胞，使细胞的浓度 为5×10⁶/ml

10.每孔加入3.5ml的细胞悬液并放入37℃，5％CO2的孵箱

11.种板72小时后，吸出全部旧培养液，加入3.5ml的新鲜培养液

12.在上述条件下，当细胞在第1周至第2周内有70-80％的汇合时，就 可进行传代。

MSC的传代培养

材料和推荐试剂：

·含10mM HEPES(钠盐)且无Ca2+和Mg2+的PBS液

·胰蛋白酶-EDTA液(0.25％胰蛋白酶和0.01％EDTA).

1.为取得最好的效果，在37℃下，预热PBS

2.移去培养液，至少用1ml的PBS洗单(细胞)层两次

3.加50μl/cm²胰蛋白酶-EDTA，37℃孵育5-10分钟(第一到 三传代)。从第四代起，消化时间约2分钟

4.用两倍体积的完全培养液再悬浮细胞，分装到两个新的培养瓶中 (1:2传代)

5.当细胞汇合时，重复步骤1-4。到达汇合时，首次传代可能需 要半个月

MSCs培养和传代的建议

·每3或4天更换培养液

·要避免因过多的基质造成细胞无效的分离，避免细胞汇合过度

·注意消化时间的掌握，不需要一定要将所有的细胞都消化下来

·这个实验步骤至少可应用于C57BL和mdx小鼠

附图说明：

1.图1第九代小鼠间充质干细胞的流式细胞结果；

2.图2小鼠间充质干细胞光镜图片(40×)；

3.图3小鼠间充质干细胞成骨图片(100×)；

4.图4小鼠间充质干细胞成脂图片(100×)。

第九代小鼠间充质干细胞的流式细胞结果(图1)、普通光镜(图2)及成 骨(图3)及成脂(图4)。