[发明专利]黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体和表达产物及其构建制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的鱼类基因工程，尤其是具有抗菌活性的黑鲷抗菌肽Hepcidin的表达载体的构建及其制备方法。

背景技术

Hepcidin是一个在C端保守位点上富含半胱氨酸残基的抗菌肽家族。它们的C末端都保留了半胱氨酸形成的富集区，CD(circular dichroism，圆二色)光谱学特性研究证实，在磷酸缓冲液中hepcidin具有两个稳定的β折叠结构，这一结构与抗菌多肽的胱氨酸(cystin-eknot)结构非常相似。富含半胱氨酸的抗菌肽已在昆虫的脂肪体、软体动物和甲壳动物的血淋巴、哺乳动物的上皮细胞和循环细胞如嗜中性粒细胞、巨噬细胞中分离出来。此类抗菌肽有抗真菌和革兰氏阳性、阴性菌的活性。2000年，Krause et al(Krause A，Neitz S，MagertHJ，Schulz A，Forssmann WG，Knappe PS，Adermann K.LEAP-1，a novel highly disulfide-bonded human peptide，exhibits antimicrobial activity[J].FEBS Lett.，2000，480：147-150)最早从人类血浆中首先发现了LEAP-1(后称为hepcidin)，曾用化学合成该多肽检测了hepcidin的抗菌活性，结果发现hepcidin能够剂量依赖性(Dose-dependent)的抑制革兰氏阳性菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和革兰氏阴性菌灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)的生长，但是对大肠杆菌(E.coli BL21 G-)和萤光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens G-)没有活性，此hepcidin对枯草芽孢杆菌的半数抑制浓度(half-maximal inhibitoryactivity，IC50)为40μg/ml(14.4μM)。而Park et al(ParkCB，Lee JH，Park IY，Kim MS，Kim SC.A noval antimicrobial peptide from the loach，Misgurnus anguillicaudatus[J].FEBS Lett.，1997，411：173-178.)从人类尿液中分离的Hep20和Hepc25天然产物，在30μM浓度下对大肠杆菌(E.coli ML35P G-)的生长则具有较强的抑制作用，对金色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等革兰氏阳性菌的生长抑制作用较弱，对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa G+)没有抑制作用。

鱼类抗菌肽的研究加深了人们对低等脊椎动物免疫防御机制的认识，为日益严重的鱼类病害防治开辟了崭新的途径。抗菌肽药物在海水养殖鱼类的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗菌和治疗药物，因而获得高产量的抗菌肽是其在水产养殖业推广应用的前提，但直接从鱼类提取或利用化学方法人工合成天然的抗菌肽，受动物来源和化学合成方法的局限，很难获得足够量的抗菌肽，且费用昂贵。利用分子生物学技术可以克隆获得海水养殖鱼类的抗菌肽基因，通过建立海水养殖鱼类抗菌肽基因表达工程菌，可以在体外产业化生产抗菌肽；而用抗菌肽产品替代抗生素添加到饲料，饲喂海水养殖鱼类，不仅可以提高鱼体的免疫抗病力，增加其产量，同时还可以避免抗生素在鱼体中的蓄积，提高水产品质量，从而解决目前困扰我国海水养殖生产中的细菌耐药性及水环境和水产品抗生素污染等问题。