[发明专利]一种云柚菇抗病毒蛋白及其分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物蛋白及其分离纯化方法，特别是一种云柚菇抗病毒蛋白及其分离纯化方法。

背景技术

地球上约有5,000多种食用菌，中国已知的不少于850种。但是人们对于食用菌中的抗病毒抗肿瘤活性蛋白的研究尚处在起步阶段。食用菌大都药食同源，目前虽然国内外开发出种类繁多的食用菌营养液和抗肿瘤免疫调节剂，但是纯化的活性物质大都为多糖(水野卓，1987)，其中蛋白类物质很少得到分离纯化。

从天然产物中寻找活性成分是当今抗病毒抗肿瘤药物的发展策略之一，各国学者都非常重视从天然产物中寻找新的化学结构(丁健，2001；江山，1992)。食用菌中生物活性物质，特别是蛋白质非常丰富，其无毒、无残留、对人体和环境无害，于是食用菌又成为开发天然药物资源的热点。

云柚菇是从云南柚树上分离、最近得到驯养的中国特有食用菌种，它的分类地位未定，暂时归入Agrocybe属中。付鸣佳(2002b)和孙慧检测Agrocybe属杨树菇(Agrocybe aegerita)粗汁液对TMV的抑制率达100％。据报道杨树菇(Agrocybe aegerita)子实体热水提取物对小白鼠肉瘤和艾氏腹水瘤的抑制率分别为90％和80％(黄年来，1998)。

发明内容

本发明的目的是提供一种云柚菇抗病毒蛋白及其分离纯化方法。

本发明的材料来源：云柚菇(Agrocybe sp.)子实体购自云南农贸市场。层析介质：阴离子交换介质DEAE-sepharoseFF和凝胶层析介质Sephacryl S-200 High Resolution均购于Amersham Pharmacia Biotech公司。FD-8冷冻干燥机购白北京博医康技术公司。试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基tris、十二烷基硫酸钠(SDS)等购于上海生工生物工程技术服务有限公司；低分子量标准蛋白为上海生化所产品；两性电解质Ampholine pH3.5-10(上海产)购于北京经科化学试剂经营公司；对-硝基苯基磷酸二钠(p-Nitrophenyl phosphate，pNPP)为Sigma公司产品；硝酸纤维素膜购自上海生工生物工程技术服务有限公司；1640培养基为Gibco公司产品；新生小牛血清(FBS)为杭州四季青生物工程材料公司产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司。其它生化试剂均为国产分析纯产品。

毒源为烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)；

供试寄主为心叶烟(Nicotiana glutinosa)作为TMV的枯斑寄主。

云柚菇抗病毒蛋白的分离纯化方法，包括以下步骤：

1、制备云柚菇蛋白粗提液：取云柚菇子实体粉末加蒸馏水浸提，使用(NH₄)₂SO₄分级盐析，离心，以及透析等方法得到云柚菇蛋白粗提液C液；

2、离子交换层析：云柚菇蛋白粗提液C液上用pH7.8，0.01mol/L PBS缓冲液平衡后的DEAE-sepharoseFF柱，0-0.3mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，流速1.0-2.0mL/min，分部收集流出液，选紫外吸收值最高的流出液作透析处理，经抗TMV活性检测后得D液；

3、凝胶层析：将D液上样到用含0.15mol/L NaCl的pH7.8，0.01mol/L PBS缓冲液平衡后的Sephacryl S-200柱，流速0.1-0.5mL/min，分部收集流出液，选紫外吸收值最高的流出液作透析处理，进行抗TMV活性和纯度检测，得YY蛋白液，即云柚菇抗病毒蛋白液。

本发明的云柚菇抗病毒蛋白的抗TMV病毒试验，YY蛋白与TMV孵育后电镜观察显示，YY蛋白均匀吸附在病毒粒子上；YY蛋白与TMV外壳蛋白混合后PAGE电泳表现出结合现象。表明YY蛋白是通过其与病毒外壳蛋白结合，导致病毒失去侵染力。以云柚菇粗提液作抑制TMV的试验表明，云柚菇粗提液对TMV的抑制率较高，可达94.3％(见表1)。

表1几种食用菌粗提液对TMV的抑制率的比较