[发明专利]抗氧化及预防糖尿病发生的融合蛋白的制备方法及其应用

权利要求书

1.抗氧化及预防糖尿病发生的融合蛋白的制备方法，其特征在于其包括以下步骤：

1)根据ProTα的基因序列，设计上游引物P1和下游引物P2，上游引物P1和下游引物P2分别为：

上游引物P1：5’GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’，

下游引物P2：5’GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’，

将上游引物P1引入BamHI酶切位点，将下游引物P2引入EcoRI酶切位点；

2)采用RT-PCR方法获得前胸腺素α原全长基因cDNA，将PCR产物纯化后与pMD18-TVector连接，重组载体命名为TP，转化DH5α感受态细胞，将鉴定的阳性菌液测序；

3)采用生物学软件DNAman对7个单克隆基因序列和参考的proTα的基因序列进行比对；

4)用EcoRI和BamHI双酶切ProTαPCR产物，将ProTα基因片断插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX 6P-1中，命名为PP，转化大肠杆菌BL21，获得转基因BL21菌株，在LB培养基37℃培养，加入IPTG，37℃诱导表达，菌液离心后的沉淀用上样缓冲液溶解，沸水浴后离心取上清，进行SDS-PAGE电泳，获得融合蛋白。

2.如权利要求1所述的抗氧化及预防糖尿病发生的融合蛋白的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述的转化大肠杆菌BL21，获得转基因BL21菌株可经过超声破碎后离心，得上清，将上清经过GST亲和层析柱分离纯化获得高纯度的GST-Proα融合蛋白。

3.如权利要求1所述的抗氧化及预防糖尿病发生的融合蛋白的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述的在LB培养基37℃培养在培养至OD_500nm为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达的时间为5h，菌液离心后的沉淀用等体积的上样缓冲液溶解，沸水浴中10min后离心取上清，进行SDS-PAGE电泳。

4.如权利要求1所述的抗氧化及预防糖尿病发生的融合蛋白在制备抗氧化药物中的应用。

5.如权利要求1所述的抗氧化及预防糖尿病发生的融合蛋白在制备预防糖尿病药物中的应用。