[发明专利]重组FN多肽在制备败血症等严重感染疾病的药物中应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种医药领域，尤其属于重组FN肝素结合域多肽的制备及其在败血症等严重感染、血小板减少出血和弥漫性血管内凝血的药物中应用。

背景技术：

纤维连接蛋白，fibronectin，以下简称FN；重组纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽，含237个氨基酸，分子量为29kDa，简称rhFNHN-29，重组纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽，含272个氨基酸，分子量为36kDa，简称rhFNHC-36；纤维连接蛋白肝素结合域I，即纤维连接蛋白N端肝素结合域，简称HepI；纤维连接蛋白肝素结合域II，即纤维连接蛋白C端肝素结合域，简称HepII；弥漫性血管内凝血，Disseminated IntravascularCoagulation，简称DIC；Ampicillin，氨苄青霉素，简称Amp；牛血清白蛋白，简称BSA；T载体，简称pGEM-T@vector；YPD培养基，简称YPD；含甲醇培养基，简称BMMY；含甘油培养基，简称BMGY；Lipopolysaccharide内毒素脂多糖，简称LPS；D-Galactosamine半乳糖胺，简称GalN。

纤维连结蛋白(FN)是一个多功能的大分子糖蛋白，与细胞的粘连、迁移过程相关，参与胚胎发生、损伤修复、止血、自主防卫、肿瘤转移等。它广泛存在于细胞外基质、基底膜及各种体液。体内FN可分血清FN和细胞FN，前者由肝细胞合成和分泌，后者主要由成纤维细胞合成分泌，其他多种细胞也可合成分泌FN。FN基因位于2q34，有二个转录变异型的全序列已经测定完毕，FN1和FN2。FN基因可在三个位点进行差异剪接，产生近20种不同的转录本和结构功能相异的蛋白质。

FN分子是一个二聚体，其单体亚单位由三种类型(I、II、III型)的结构域重复不同次数构成。其中I型结构域重复出现12个，II型结构域重复出现2个，III型结构域重复出现16个。12个I型结构域的氨基酸组成数目：36、39、44、45、45、31、39、38、39、45、42、41。平均40.33±4.249，其中45个出现三次，39个出现三次。2个II型结构域的氨基酸组成数均为49个。16个III型结构域的氨基酸组成数目：70、54、66、79、77、88、91、65、78、80、79、79、91、79、78、79，平均77.07±9.61，其中79个出现五次，78个出现二次。

败血症(Sepsis)和弥漫性血管内凝血(DIC)，是临床常见危重症。败血症尤其由其产生的感染性休克容易诱发弥漫性血管内凝血(DIC)，而一旦形成弥漫性血管内凝血(DIC)，又进一步加重休克。由DIC引起的出血危害性极大。DIC也可导致多器官功能衰竭等严重的并发症，病死率高。

血液病患者常表现为感染和血小板减少出血并存的情况。由于感染和出血相互影响，形成恶性循环，临床上血液病患者内毒素血症和出血的发生率和死亡率都很高。

纤维连接蛋白(FN)是细胞外基质的重要成份，为一种具有多种功能的糖蛋白大分子，能与肝素、胶原、纤维蛋白以及整合素家族的细胞表面受体结合，参与细胞的粘附与迁移、止血过程、损伤修复、在抗感染、维持微血管的完整性等方面具有重要作用，故曾有“调理性α2表面结合蛋白”，“细胞表面蛋白”及“细胞粘附因子”之称。大量的临床研究表明血浆纤维连接蛋白FN水平对于感染性休克、弥漫性血管内凝血(DIC)的预后判断具有重要意义。这些病人血浆FN水平明显而急剧地下降。若给败血症患者补充富含FN的冷沉淀物(cryoprecipitate)，则在患者血浆FN水平恢复的同时，伴有心肺功能的改善及败血症的控制，DIC的发生率也明显下降。Barkagan等给106例败血症伴DIC患者输注含FN的冷沉淀物，取得显著疗效。Brodin B等给26例严重感染住院患者补充冷沉淀物，观察血浆FN水平及DIC相关指标的变化，结果发现，患者血浆FN水平恢复正常，且无一例发生DIC。提示FN可用于治疗败血症及DIC。由于从血浆中分离FN将造成血资源的浪费和可能传播血源性传染病，同时由于FN是一种大分子量的糖蛋白，其分子量高达450kDa，利用基因工程合成整个FN分子，目前技术上存在着一定的困难。因此本研究在以往成功制备重组FN细胞结合域多肽(rhFN55)，发现其具有治疗败血症小鼠和DIC大鼠作用的基础上，制备重组FN肝素结合域多肽，并研究其对败血症小鼠和DIC大鼠的治疗作用。