[发明专利]一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种宏基因组文库的构建，尤其是涉及一种红树林土壤大片段宏基因组文库的构建方法。

背景技术

在环境宏基因组文库的构建过程中，原位裂解提取法较间接提取法所获得的环境DNA(environmental DNA，eDNA)具有产量高，更真实代表环境中微生物群落的真实信息等优势。目前，已有许多基于原位裂解提取法的小片段(插入片段为3-10kbp)环境宏基因组文库的报道(1、Henne A，Schmitz RA，Bomeke M，et al.Screening of environmental DNA libraries for thepresence of genes conferring lipolytic activity on Escherichia coli[J].Appl.Environ.Microbiol.，2000，66(7)：3113～3116；2、Gabor EM，de Vries EJ and Janssen DB.Construction，characterization，and use of small-insert gene banks of DNA isolated from soil and enrichmentcultures for the recovery of novel amidases[J].Environ.Microbiol.，2004，6(9)：948～958；3、YunJ，Kang S，Park S，et al.Characterization of a novel amylolytic enzyme encoded by a gene from asoil-derived metagenomic library[J].Appl.Environ.Microbiol.，2004，70(12)：7229～7235；4、Ranjan R，Grover A，Kapardar RK，et al.Isolation of novel lipolytic genes from unculturedbacteria of pond water[J].Biochem.Biophys.Res.Commun.，2005，335(1)：57～65；5、Ferrer M，Golyshina OV，Chernikova TN，et al.Novel hydrolase diversity retrieved from a metagenomelibrary of bovine rumen microflora[J].Environ.Microbiol.，2005，7(8)：1996～2010)。然而迄今，运用原位裂解法提取eDNA构建大片段DNA插入文库仍然存在特殊困难，通过直接裂解法获得能满足于构建大片段文库质量所需DNA的报道很少(Patrick Robe，Renaud Nalin，Carmela Capellano，et al.Extraction of DNA from soil[J].European Journal of Soil Biology，2003，39(4)：183～190)，尤其，当研究对象为粘质及有机质含量高的土壤样品时，更加困难(ZhouJ，Bruns MA，and Tiedje JM.DNA recovery from soils of diverse composition[J].Appl.Environ.Microbiol.，1996，62(2)：316～322)。具体表现为：(1)即使采用最温和的裂解方法，所得的土壤eDNA片段大小仍无法突破100kb(1、Patrick Robe，Renaud Nalin，Carmela Capellano，etal.Extraction of DNA from soil[J].European Journal of Soil Biology，2003，39(4)：183～190；2、Zhou J，Bruns MA，and Tiedje JM.DNA recovery from soils of diverse composition[J].Appl.Environ.Microbiol.，1996，62(2)：316～322)。裂解微生物细胞所释放的DNA，尤其是大片段的DNA极易重新吸附于土壤颗粒(clay)并易遭受核酸酶袭击，造成eDNA产量虽高，实际上大片段DNA所占比率低下，不足以构建宏基因组文库。(2)土壤中腐质酸、黄腐酸及腐质酸类等抑制性物质与eDNA共提取、共纯化问题难以解决(1、Krsek M，Wellington EM.Comparison of different methods for the isolation and purification of total community DNA fromsoil[J].J Microbiol Methods.，1999，39(1)：1～16；2、Tsai YL and Olson BH.Rapid method forseparation of bacterial DNA from humic substances in sediments for polymerase chain reaction[J].Appl.Environ.Microbiol.，1992，58(7)：2292～2295；3、Voget S，Leggewie C，Uesbeck A，et al.Prospecting for novel biocatalysts in a soil metagenome[J].Appl.Environ.Microbiol.，2003，69(10)：6235～6242；4、Daniel R.The soil metagenome-a rich resource for the discovery ofnovel natural products[J].Curr.Opin.Biotechnol.，2004，15(3)：199-204；5、Pettit RK.Soil DNAlibraries for anticancer drug discovery[J].Cancer.Chemother.Pharmacol.，2004，54(1)：1～6)。因此，在土壤宏基因组文库的构建过程中，不同提取及纯化方法的比较研究及优化，提取与纯化方法的不同组合研究及优化，到最终确定一个行之有效的方案，不仅费时费力，且不一定能得到满意的结果。当前商业化的eDNA提取试剂盒也无力解决这些问题，通过试剂盒得到的DNA片段往往小于20kb，最终只能产生小片段的插入文库(1、Gabor EM，de Vries EJand Janssen DB.Construction，characterization，and use of small-insert gene banks of DNAisolated from soil and enrichment cultures for the recovery of novel amidases[J].Environ.Microbiol.，2004，6(9)：948～958；2、Ranjan R，Grover A，Kapardar RK，et al.Isolation of novellipolytic genes from uncultured bacteria of pond water[J].Biochem.Biophys.Res.Commun.，2005，335(1)：57～65)。