[发明专利]一种高效裂解衣原体胞壁的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学领域，衣原体属(Chalmydia)，不同衣原体种的衣原体胞壁的裂解技术，特别提供了一种高效裂解衣原体胞壁，充分释放胞内物质，并保持其完整生物学活性。提高了分子生物检测方法检测衣原体感染的灵敏度和准确性。

技术背景

衣原体易感人类、哺乳动物和禽类，引起肺炎、结膜炎、鼻炎和腹泻等，在家畜以流产和肺炎为特征，是一类十分重要的自然疫源性人兽共患疾病的病原体，严重地危害人畜禽类的健康，同时对我国公共卫生事业造成极大的影响。衣原体在生物学分类上属于衣原体属(Chalmydia)，是一类在真核细胞内专营寄生生活的微生物。多呈球形或卵圆形大小不同的颗粒，直径0.2～1.5μm。衣原体内含有DNA和RNA两种类型的核酸；具有独特的发育周期，具有独立的酶系统，能分解葡萄糖释放CO₂，有些还能合成叶酸盐，但缺乏产生代谢能量的作用，必须依靠宿主细胞的代谢中间产物，因而表现严格的细胞内寄生。衣原体具有粘肽组成的胞壁，常规采用裂解衣原体胞壁的方法是：置衣原体样品在-20～-40℃冷冻，取出于室温融解，再冷冻，如此反复冻融三次，其目的是导致衣原体胞壁破裂，释放胞内具生物学活性物质于介质中；或采用石炭酸、木瓜蛋白酶或加温60℃所破坏，此类方法会导致核蛋白质变性，丧失其生物学活性。

衣原体都可在6～8日龄鸡胚卵黄囊中繁殖，或采用HeLa细胞、猴肾细胞、人羊膜细胞培养增殖。当前，人、畜和禽类感染衣原体的诊断方法多采用设计不同的特异性引物，应用多聚酶链式反应(PCR)可特异性地诊断沙眼衣原体，肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体感染，PCR检测方法具有敏感性高，特异性强的特点，现被广泛应用。但提供PCR检测衣原体的样品需将衣原体胞壁进行裂解，使胞内核酸释放于介质中作为检测样品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效裂解衣原体胞壁的方法，采用本方法会使核蛋白质保持较高的生物学活性。

本发明提供了一种高效裂解衣原体胞壁的方法，其特征在于：将衣原体样品放置-80℃，10～12h；取出后放入预冷-50℃左右的真空杯中，维持负压5.5×10^-1mbar，2-3h。

本发明高效裂解衣原体胞壁的方法中，所述衣原体样品最好来源于鸡胚卵黄囊膜或细胞培养物。

采用本发明方法针对不同种的衣原体样品进行处理后，采用多聚酶链式反应(PCR)实验结果显示，本方法可高效裂解衣原体胞壁，充分释放胞内核酸，提高核酸检测灵敏度和准确性，从而提高人、畜、禽类感染衣原体感染的诊断率。

具体实施方式：

具体操作步骤：鸡胚卵黄囊膜或细胞培养衣原体样品0.5～1毫升放置-80℃，10～12h(或过夜)，取出后放入预冷-50℃左右的真空杯中，维持负压5.5×10^-1mbar，2-3h后，使样品中衣原体胞壁高效裂解，胞内核酸物质充分释放于介质中，并保持其较高的生物学活性。

实施例1

采用本发明方法裂解衣原体样品：采集湖北省某县24户农户饲养猪63份粪便样品(份/个体)，样品经无菌处理后，在无菌条件下接种6～8d龄鸡胚卵黄囊腔，37℃培养7天，收集3～6天死亡鸡胚的卵黄囊膜，用组织匀浆器制成卵黄囊膜匀浆。分别设计沙眼衣原体，肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体的特异性引物，进行多聚酶链式反应(PCR)检测实验，结果如下：

比较例1-1：

63份样品同上，采用常规采用裂解衣原体胞壁的方法是：置衣原体样品在-20～-40℃冷冻，取出再室温溶解，再冷冻，如此反复冻融三次。PCR检测方法同上，结果如下：

比较例1-2

63份样品同上，采用常规采用裂解衣原体胞壁的方法是：加温60℃后，如上述方法作PCR检测，结果如下：

实施例2

采用本发明方法裂解衣原体样品：采集湖北省某县3农户饲养观赏鹦鹉鸟110份粪便样品(份/个体)，样品经无菌处理后，在无菌条件下接种6～8d龄鸡胚卵黄囊腔，37℃培养7天，收集3～6天死亡鸡胚的卵黄囊膜，用组织匀浆器制成卵黄囊膜匀浆。分别设计沙眼衣原体，肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体的特异性引物，进行多聚酶链式反应(PCR)检测实验，结果如下：

比较例2-1：

110份样品同上，采用常规采用裂解衣原体胞壁的方法是：置衣原体样品在-20～-40℃冷冻，取出再室温溶解，再冷冻，如此反复冻融三次。PCR检测方法同上，结果如下：