[发明专利]一种利用中国红豆杉细胞诱导产生紫杉烷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物细胞培养技术，具体地说是一种大幅度提高中国红豆杉细胞培养生产紫杉烷的产量并促使其外泌，同时诱导新紫杉烷化合物产生的方法。

背景技术

紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌、乳腺癌的一线用药，是迄今为止少数几个最具抗癌活性的天然化合物之一，每年有数十亿美元的销售额，但药源问题仍然是紫杉醇研究者们要解决的首要问题。全世界能够生产紫杉醇的植物种类不多，生长缓慢，紫杉醇的含量极低，即使在含量最高的树皮中平均也只有万分之一点五。而通过砍伐红豆杉属植物来获取紫杉醇严重破坏生态平衡和生物多样性，最终将导致资源枯竭。紫杉醇化学全合成虽然早已成功，但合成路线长，产率低，成本高，不能商业化生产。半合成是目前临床应用紫杉醇的主要来源，半合成的前体为由红豆杉枝叶中分离得到的baccatinIII(巴卡亭III)或10-deacetylbaccatin III(10-脱乙酰基巴卡亭III)，但依然远远满足不了临床及实验的需要。利用植物细胞培养方法生产紫杉醇因其环境友好、生产周期短、可控性强等优点日益受到人们的重视。但不产紫杉醇或紫杉醇产率低仍然是该项技术普遍面临的难题。

在努力拓展紫杉醇的药源并提高紫杉醇产量的同时，科学家亦投身到紫杉烷类化合物的研究中，期望找到抗癌活性更好的紫杉烷类化合物或者找到合适的先导化合物。已经有几百种紫杉烷从紫杉原植物或细胞培养液中分离出来。云南紫杉烷Tc(Taxuyunnanine C)是一种具有类神经生长因子(NGF)活性的化合物，能够强化NGF的作用，有利于老年痴呆症(Alzheimer’s disease)的治疗。Tc与紫杉醇同属于三环二萜类化合物。其结构式如下：

Tc被推测是紫杉醇生物合成途径中的代谢中间产物，可以作为紫杉醇或其它有用化合物合成的前体，具有潜在的商业价值。自从在中国红豆杉悬浮细胞培养体系中发现含量较高的Tc以来，华东理工大学的钟建江教授所在的生物反应器国家重点实验室使用各种调控技术提高Tc的产量，使Tc产量在1升气升式反应器中达到612mg/L。后来他们实验室又与钱旭红教授合作，使用后者合成的新诱导子，使得摇瓶中Tc的最高产量达827mg/L，反应器中Tc的最高产量达738mg/L。Choi et al.Tc在中国红豆杉细胞培养第35天获得Tc的最高产量为885.9mg/L。综观提高Tc产量所使用的各种调控技术，均着眼于对Tc生物合成途径的调控，很少关注对Tc后生物合成途径-即Tc合成后贮存和转运方面的调控。这正是我们这项技术的发明点所在：通过在中国红豆杉悬浮细胞培养体系中添加合适的吸附剂，使Tc由胞内被高效地吸附到胞外，从而解决高含量Tc累积在胞内时对细胞生长的伤害，对Tc进一步生产的阻遏。这项既对Tc生物合成过程进行调控亦对其后生物合成过程进行调控的技术大大增加了Tc产量进一步提高的空间和潜力。

在中国红豆杉悬浮培养体系中，通过诱导剂诱导、补糖添加及吸附剂联合调控来提高云南紫杉烷产量，还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用中国红豆杉(Taxus chinensis)悬浮培养体系，以诱导剂重复诱导、补糖及吸附剂添加相结合的联合调控手段提高云南紫杉烷产量同时诱导新紫杉烷化合物产生的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：将中国红豆杉细胞置于其常用培养基中培养，细胞接种量为50～200g/L湿重，在细胞指数生长初期，于每升培养基中加入浓度为1～2000μM的诱导剂、50-200g的无菌吸附剂和10～50g的糖；在细胞指数生长中期，再次加入浓度为1～2000μM的诱导剂；所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子。

所述非生物诱导剂为硝酸银、水杨酸或茉莉酸及其衍生物，所述糖为蔗糖或葡萄糖；所述衍生物为甲基茉莉酸酮酯(MJA)、2-羟乙基茉莉酸(HEJA)、3-氟乙基茉莉酸(TFEJA)或2，3-二羟丙基茉莉酸(DHPJA)。

中国红豆杉细胞的培养条件为：旋转式摇床，转速60～200rpm，培养温度为20～30℃，暗培养；培养周期为15～30天，每隔14-20天传代一次；所述细胞指数生长初期是指细胞接种于培养基后的第4～10天，即诱导剂的第一次添加时间；细胞指数生长中期是指细胞接种于培养基后的第10～15天，即诱导剂的第二次添加时间；

在第一次添加诱导剂和第二次添加诱导剂的期间还可添加紫杉烷的的合成前体0.25～2.0克/每升培养基；合成前体可为醋酸钠或苯甲酸。

所述吸附剂为经处理对紫杉烷类化合物有较强的吸附能力并对细胞无毒的多孔材料，如各种大孔吸附树脂。