[发明专利]一种适用于微囊化CHO细胞的无血清培养基及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养与移植，具体地说是一种适用于微囊化中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的无血清培养基及其应用。

背景技术

微囊化细胞培养与移植是有广阔应用前景的人工器官与药物释放技术，可以应用于很多种疾病的治疗，包括：糖尿病、肝衰竭、肿瘤等。该技术由TMS Chang(文献1.Chang T M S，1964.Semipermeable microcapsules.Science 146，524-525)于1964年提出。由于微囊膜具有选择透过性与免疫隔离性，从而减少细胞移植过程中免疫抑制剂的使用。另外微囊化技术已开始用于细胞大规模培养、单克隆抗体生产等生物工程领域。目前微囊化细胞培养以及移植前期均采用含10％牛血清培养基进行培养与保存，血清使用存在下列不足：1)含有潜在的细胞毒作用和动物源性污染的危险，在微囊化细胞移植过程中会产生不良影响。2)血清的含量非常复杂，增加生物产品的下游分离纯化难度与成本。3)血清批次之间的差异增加了微囊化细胞产品的不稳定性。4)血清中所含蛋白质在微囊化细胞培养时可能导致微囊膜污染而影响物质转运，导致囊内细胞因营养物质失衡而死亡。

虽然目前商品化的培养基种类很多(文献2.一种适合中国仓鼠卵巢细胞培养的无血清培养基.申请号200410018258.0)，但尚无针对微囊化细胞代谢特点而设计的专用无血清培养基。De Castro M(文献3.De Castro M，2006.Evaluation ofhuman serum albumin as a substitute of foetal bovine serum for cell culture.International Journal of Pharmaceutics 310(1-2)：8-14)等尝试用人血清蛋白替代血清进行细胞培养取得一定进展。因此，适合微囊内细胞生长与代谢特点的、对微胶囊稳定性无明显影响的、成分符合临床移植安全要求的无血清培养基具有很好的市场前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合微囊化CHO细胞生长和产物表达的无血清培养基。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种适用于微囊化CHO细胞的无血清培养基，其包括DMEM/F12标准培养基和下列添加物，

胰岛素5-15mg/L，大豆卵磷脂10-40mg/L，吐温8020-40mg/L，环庚三烯酚酮(Tropolone)1-5μM，柠檬氨铁(FAC)0.1-1mg/L，亚硒酸钠2.5-10mg/L，β-巯基乙醇20-50μM，

氨基酸需额外添加有如下：

L-天冬氨酸1-5mg/L，L-甘氨酸3-20mg/L，L-精氨酸1-10mg/L，L-脯氨酸1-10mg/L，L-组氨酸1-10mg/L，L-赖氨酸1-10mg/L，L-半胱氨酸3-20mg/L，L-谷氨酰氨100-400mg/L。

其中：

1.胰岛素：作用是促进细胞的生长、对葡萄糖和氨基酸的利用以及糖原和脂肪酸的合成。

2.环庚三烯酚酮(Tropolone)与柠檬氨铁(FAC)：两者联合可与细胞表面受体结合传递铁离子，代替传统培养基中转铁蛋白的作用。

3.大豆卵磷脂(PA)：促进细胞的生长与产物合成并且与微囊制备过程中的钙盐无反应。

4.β-巯基乙醇：促进胱氨酸的吸收，可使谷胱甘肽处于还原状态，从而保护细胞免受过氧化氢的损害。

5.亚硒酸钠：对细胞有着显著的生长支持效应，其作用与硒作为谷胱甘肽过氧化酶的成分有关，它保护细胞不受过氧化物的毒性影响。

6.氨基酸类：满足细胞生长需要。根据微囊化细胞氨基酸代谢特点，在DMEM/F12标准培养基基础上添加一定量的氨基酸。

所述无血清培养基适用于根据聚电解质络合原理制备的含CHO细胞的生物微胶囊，适于微囊化CHO细胞的培养。

所述微胶囊为海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微胶囊或海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)微胶囊。

本发明培养基具有以下特点：

1.根据微囊化CHO细胞氨基酸代谢特点添加成分，从而促进细胞生长。

2.添加成分均为明确的小分子物质，易于微囊化细胞吸收，同时利于提高移植生物安全性。

3.蛋白含量低，除胰岛素外均为非动物源性成分，减少微囊化CHO细胞产生的生物产品的下游分离纯化难度与成本，同时利于提高移植生物安全性。

4.不添加任何动物血清成分。添加成分对微胶囊性能无明显不良影响。