[发明专利]一种土壤微生物基因组DNA提取方法

权利要求书

1.一种土壤微生物基因组DNA提取方法，其特征在于按如下步骤 操作：

1)初步裂解微生物细胞：取土壤样品与石英沙相混合放入含有 850-1000μl提取缓冲液的离心管中，其中土壤样品与石英沙重量比 为1∶0.5-2；而后将离心管置于核酸提取仪内振荡40-60秒，或在 涡旋混合器上振荡10-20分钟，得到初步裂解液；所述称取的待测土 样重量为0.3-0.8g；提取缓冲液为：50-120mM Tris-HCl、50-120 mM EDTA和1.0-1.6M NaCl；

2)进一步裂解微生物细胞：将50-100μl浓度为100mg/ml的溶 菌酶加入初步裂解液中混匀，在30-40℃温浴30-60分钟后，再加入 75-125μl 20％(w/v)的SDS，混匀，再在60-70℃温浴30-60分钟， 10000-12000转/分钟离心10-20分钟，收集上清；

3)土壤微生物基因组DNA：将收集的上清液经分离纯化得粗提 DNA溶液，而后将粗提DNA溶液纯化，即得土壤微生物基因组DNA；

所述步骤2)分离后的上清液内加入其0.1-0.3倍体积的5-10M KAc，冰浴20-60分钟后，12000-14000转/分钟离心10-20分钟，收 集上清，而后在上清液中加入其0.3-0.7倍体积的20％-60％(w/v)聚 乙二醇溶液和0.1-0.3倍体积的5M-15M NaCl溶液，混匀，室温放置 30分钟，离心收集DNA沉淀，70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，自然干燥后， 加入500-700μl TE溶解，得到粗提DNA溶液，其中聚乙二醇分子量 为6000-10000；

所述粗提DNA溶液纯化，是将所得粗提DNA溶液用与其等体积的 酚、氯仿和异戊醇的混合液抽提，取上层水相；而后再用与上层水相 等体积的氯仿和异戊醇的混合液抽提，取上层水相；而后加入0.1-0.2 倍体积的3M NaAc溶液和0.6-1.0倍体积的异丙醇溶液，混匀后室温 放置30-60分钟，离心收集DNA沉淀，70％(v/v)乙醇洗涤沉淀，自 然干燥后，加入30-50μTE溶解，得到DNA溶液；其中：酚、氯仿和 异戊醇按体积份数比为25∶24∶1，氯仿和异戊醇按体积份数比为24∶ 1。

2.按权利要求1所述的土壤微生物基因组DNA提取方法，其特征 在于：所述提取缓冲液为：100mM Tris-HCl，100mM EDTA和1.5M NaCl。