[发明专利]一种固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化工中对酶进行固定化的工艺，具体地说是一种新颖环氧基载体ZH—EP固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的方法。

背景技术

自从1929年弗莱明发现青霉素以来，青霉素为人类的医疗卫生事业作出了巨大的贡献。然而伴随着使用以致滥用，细菌对青霉素的耐药性也在不断增加。研制新型抗生素是解决问题的有效措施。20世纪60年代科研人员发现了青霉素G酰化酶(PGA；EC 3.5.1.11)，并开发了固定化酶技术用来水解青霉素和头孢菌素G生产6—氨基青霉烷酸(6—APA)和7—氨基脱乙酰头孢烷酸(7—ADCA)。而6—APA和7—ADCA是半合成抗生素的重要医药中间体。固定化青霉素酰化酶是半合成β-内酰胺抗生素的生产得以进行的重要手段。而随着社会需求的发展需要更好性能、更高效率的催化剂，来增加工业生产的竞争力。

近年来，人们已从自然界筛选到多种不同性质的青霉素酰化酶，在所有已知来源的青霉素G酰化酶中，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)青霉素G酰化酶的基因直到1994年才被克隆(文献1，美国专利5695978)，其具有许多有工业价值的特点：粪产碱杆菌青霉素G酰化酶对底物有更高的亲和力，其Km比其他青霉素酰化酶都低而其kcat是所有青霉素G酰化酶中最高的；粪产碱杆菌青霉素G酰化酶是青霉素G酰化酶家族中唯一在一级结构中具有二硫键的成员，其热稳定性和pH稳定性都很高；对手性分子的识别能力，粪产碱杆菌青霉素G酰化酶具有更高的选择性；粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在有机溶剂中有很高的稳定性；在催化β-内酰胺抗生素合成时合成/水解率高等。所以粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在半合成抗生素工业中有着更好的应用前景。

固定化能够改善酶的性质，使固定化酶比游离酶具有更好的稳定性和更高的使用效率，并且使酶能够回收利用，极大节约生产成本。固定化技术是酶能够应用于工业生产的关键技术之一。经过几十年的研究和发展，先后开发了多种性能多样的固定化载体和方法，固定化技术取得了长足的进步，然而仍不能满足理想生物催化剂的所有要求，真正能投入工业应用的固定化酶却不多，主要原因是固定化使用的试剂和载体成本高，其次是固定化效率低，稳定性差；并且出于商业保密，很多工艺过程细节没有公开。我国相关工作起步较晚，尚需依靠进口来满足半合成抗生素的生产，因此研究高效的固定化青霉素酰化酶具有重要意义。

近代生物工程的技术进步可以对酶进行分子水平上的改造改善酶的结构功能获得活力更高的酶，并依靠酶工程的进步将酶固定化获得更适合大规模工业生产的生物催化剂。我们已将粪产碱杆菌青霉素G酰化酶基因，转化在大肠杆菌中构建了高表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的基因工程菌，无需诱导即可进行组成型高表达(文献2，袁中一等，中华人民共和国专利，ZL200310108792.6)。在获得粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的基础上，申请人又进行了粪产碱杆菌青霉素G酰化酶固定化酶的研究。

考察一种新载体的固定化条件，其工艺流程为考察酶浓度、pH、盐浓度、温度等条件，以固定化酶活力、温度稳定性、pH稳定性及使用稳定性为评价指标。

发明内容

本发明的目的是筛选新的固定化载体应用于粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的固定化，获得固定化酶产品；并以粪产碱杆菌青霉素G酰化酶为模型，建立起应用新载体对酶进行固定化的一般工艺流程。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的方法，固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的载体为ZH—EP，于缓冲溶液体系中，以ZH—EP进行固定化时，酶浓度为100-160mg/ml，固定化时间106-120h，缓冲溶液pH8.5—10.0，反应体系中盐的浓度1.0-1.5M，载体与缓冲溶液的重量体积比例为1g载体：4—6ml缓冲溶液。

当体系中缓冲溶液的浓度低于1.0-1.5M，体系中不足的离子强度可以用可溶性盐补充，使反应体系中盐的浓度1.0-1.5M(如，采用浓度0.05M的缓冲溶液，补加1.0-1.5M NaCl。)。

本发明建立了环氧基团为活性基团的环氧载体对粪产碱杆菌青霉素G酰化酶的固定化。

本发明还对粪产碱杆菌青霉素G酰化酶采用工业化通用载体Eupergit C进行了固定化，并对其固定化条件进行了研究，确定了以Eupergit C进行固定化时，其最佳条件为80-160mg/ml，固定化200-320h，缓冲溶液pH7.0—9.5，缓冲溶液浓度0.4-0.8M。

本发明具有如下特点：