[发明专利]具有抗肿瘤作用的文蛤蛋白、基因序列及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生化与生物医药领域，具体涉及由文蛤(Meretrix meretrix L.)中分离纯化的一种抗肿瘤蛋白(MML35)、该蛋白的基因序列以及该蛋白的制备方法和在预防和/或治疗肿瘤疾病等领域的应用。

背景技术

恶性肿瘤是一种发病率高、严重威胁人类健康的疾病，因此，肿瘤的治疗方法及新的抗肿瘤药物研究已成为世界各国医学科学研究领域的重大课题。目前，临床上应用的抗肿瘤药物仍以细胞毒类药物为主，这类药物对肿瘤虽然具有一定的疗效，但存在选择性差、毒副作用大等无法克服的缺点，临床上迫切需要开发新型有效的抗肿瘤药物。

由于海洋生态环境的特殊性，使得海洋生物具有某些陆上生物所没有的活性物质，这些活性物质具有结构新颖、高活性、耐药性低等优点，可以为新药研究和开发提供大量模式结构和药物前体。因此，沿海各国越来越重视从海洋中寻找潜在的有价值的药物，“向海洋要药”已成为药物研究的新方向。近年来，从海洋软体动物中提取的活性物质在治疗肿瘤方面显示出较好的势头，已成为国内外现代抗肿瘤药物研究的热点。

从上世纪60年代开始，国外学者首先开始从海洋贝类中分离纯化具有抗肿瘤活性的多肽/蛋白。Schmeer等从马克氏属蛤类中提取到具有抗肿瘤活性的蛤素，其在体外对S180肉瘤和Krebs腹水瘤有较好的抑制作用。80年代，日本学者分别从海兔的卵、体腔液(Coelomic fluid)、蛋白腺(Albumen gland)及喷出液(Purple fluid)等多种组织中分离获得了9种具有抗肿瘤活性的糖蛋白：Aplysianin E、A、P；Julianin E、G、S；Dolabellanin A、C、P。这9种糖蛋白在体外均能裂解K-562等多株肿瘤细胞，但对正常血细胞均不表现裂解活性。近年来，已有多种海洋来源肽类物质及其合成类似物进入临床研究。Pettit等发现的海兔(Dolabella auricularia)提取物Dolastatin10具有极强的抗肿瘤活性，90年代该产物进入临床测试，在临床II期由于神经系统副作用而未通过。由Dolastatin10改造的结构类似物Soblidotin(TZT1027)目前已经进入临床I期；Dolastatin15是另一个从海兔中提取的具有抗肿瘤活性的多肽，目前已处于临床前研究阶段。

文蛤(Meretrix meretrix L.)为海洋瓣鳃类软体动物，是我国重要的海洋贝类资源，也是我国传统的海洋中药。《神农本草经》记载：“文蛤主恶疮”，具有软坚散结、扶正去邪之效，可润五脏、止消渴、开脾胃，用于肿瘤、肺结核、高血压、肾虚耳鸣的治疗。国内已经针对文蛤的抗肿瘤活性进行了一系列的研究，其中，冷波等从文蛤中分离出分子量为3.14kD的具抗肿瘤活性的多肽，其在体外能通过破坏细胞的骨架结构显著抑制BGC-823瘤细胞的生长；吴杰连等从文蛤中分离出一种具有抗肿瘤活性的小分子糖肽，命名为MGP0501，研究发现它可以选择性杀伤多种肿瘤细胞，而不影响正常细胞生长。

本发明从文蛤中分离到一种新的具有抗肿瘤活性的蛋白。测定了该蛋白的N-末端序列。实验证实，该蛋白在体外具有诱导人肝癌肿瘤细胞株BEL-7402凋亡的活性。与现有的化疗药物相比，抗肿瘤蛋白类药物具有毒副作用小，不易产生耐药性等优点，有希望发展成为新型的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤作用的文蛤蛋白。

本发明另一目的是提供一种具有抗肿瘤作用的文蛤蛋白的制备方法。

本发明的又一个目的是测定文蛤抗肿瘤蛋白体外诱导人肝癌肿瘤细胞株BEL-7402凋亡的作用。

本发明所述的文蛤蛋白的制备方法，含有以下步骤：首先收集文蛤血淋巴，离心去沉淀，上清用硫酸氨沉淀进行分级分离，将活性部分经阳离子交换剂Celloluse-CM52分离，然后经阴离子交换剂Source15Q分离，最后经分子筛Superdex75分离。分离过程中获得的每个组分均通过对人肝癌肿瘤细胞株BEL-7402的MTT实验检测并寻找各次操作的活性峰。制备步骤具体如下：

1.将新鲜文蛤用刀剖开，收集其血淋巴，经12000rpm离心60分钟，去掉沉淀。向上清中缓缓加入硫酸氨粉末至40％饱和度，至于4℃静置过夜，经12000rpm离心60分钟，去掉沉淀，再次向上清中缓缓加入硫酸氨粉末至60％饱和度，置于4℃静置过夜，经12000rpm离心60分钟，弃掉上清，保留沉淀。