[发明专利]肿瘤治疗性疫苗CTP37CRM197免疫原及其制备方法与应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种以白喉毒素突变体CRM197为免疫载体的免疫原性组合物CTP37CRM197及其制备方法，以及此免疫原在消化道肿瘤治疗中的应用，属于医药技术领域。

(二)背景技术

CRM197(cross—reacting materials197)是白喉毒素丧失了毒性的一种突变体，参见乌其达等人，白喉毒素和相关蛋白I.分离并描述白喉毒素血清型相关突变体菌株，生物化学，1973.248：3838-3844.(Uchida，T.，A.M.Pappenheimer，Jr.and R.Gregory.al.，Diphtheria toxin and related proteinsI.Isolation and properties of mutantproteins serologically related to diphtheria toxin.J.Biol.Chem.1973.248：3838-3844.)，它是野生型白喉毒素的碱基序列中由一个碱基G突变为A，从而导致了第52位氨基酸GLY突变为GLU，参见简尼尼等人，两种白喉毒素无毒性突变体CRM45和CRM197的氨基酸序列，核酸研究，1984.Vol.12No.10，P4063—4070(G.Giannini，R.Rappuoli and G.Ratti al.，The amino-acid sequence of two non-toxic mutants ofdiphtheria toixn：CRM45and CRM197..Nucleic Acids Research.1984.Vol.12No.10，P4063—4070)。从结构上看，CRM197具有完整的白喉毒素功能结构，但实验表明，白喉毒素的A片断能与NAD结合而CRM197不能，这表明NAD结合位点的变化影响了白喉毒素的酶活性及毒性。后来研究证明CRM197与白喉毒素的差异在于52位的GLY突变为GLU，这就证明了52位的GLY在白喉毒素NAD结合位点处起着重要作用，这就导致白喉毒素酶活性位点——同NAD：EF2ADP核糖转移酶结合区发生改变，导致CRM197片断A不能EF2结合，不能对细胞起到毒性作用，参见：摩依那，克丽思天森.采用凝胶过滤和饱和硫酸氨沉淀法纯化白喉毒素和白喉类毒素方法的比较.病原微生物及免疫治疗年会.1984，92：17-23(K.Moyner，G.Christiansen，Comparison of gel filtration andammonium sulphate precipitation in the purification of diphtheria toxin andtoxoid，Acta path microbiol immunol scand sect C，1984，92：17-23)。CRM197不具有酶活性以及毒性，但具有白喉毒素的免疫原性，因此CRM197也常被用作一种免疫蛋白载体交联其它半抗原一起作为疫苗。早在1985年美国科学家就利用CRM197的免疫原性，将嗜血流感菌表面的多糖交联到白喉类毒素及CRM197的蛋白载体上制作疫苗防治呼吸道感染，从防治效果上看，两种交联疫苗在效果上没有显著差异，但都能使小孩产生较强的免疫记忆，参见：彼得.安德森，米切而，皮其切罗，瑞卡德.采用白喉类毒素或白喉毒素蛋白CRM197交联嗜血流感菌b亚型表面的多糖制备流感免疫原.临床调研杂志.1985：52-59(Porter Anderson，Micheal E.Pichichero，and Richard A.Insel.Immunogens Consisting of Oligosaccharides from the Capsule of Haemophilusinfluenzae Type b Coupled to Diphtheria Toxiod or the Toxin protein CRM197.J.Clin.Invest.1985：52-59)。美国科学家针对小儿在2岁前对于肺炎球菌疫苗(球菌表面多糖，PnPs)不能产生免疫记忆，因此将球菌表面七价多糖交联于多种蛋白载体以便在小儿2岁前能对肺炎球菌产生抗体，经过多种蛋白载体交联后的动物及临床效果比较，发现PnPs—CRM197能产生较好的免疫效果，而且安全无毒副作用，参见：布莱克，谢里蜚德，伐而曼，路易斯，瑞，汉森，艾而纹，恩塞而，哈克而，斯博而，曼李罗斯克，马夺，常仪，科白格，沃克，奥斯廷，爱德沃德.2000，交联七价肺炎球菌表面多糖疫苗在儿童体内的有效性、安全性和免疫原性.传染病学报.9：187-195(Black，S.，H.Shinefield，B.Fireman，E.Lewis，P.Ray，J.R.Hansen，L.Elvin，K.M.Ensor，J.Hackell，G.Siber，F.Malinoski，D.Madore，I.Chang，R.Kohberger，W.Watson，R.Austrian，K.Edwards，et al.2000.Efficacy，safety and immunogenicity ofheptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children.Pediatr.Infect.Dis.J.9：187-195)。目前该产品也通过美国FDA批准上市，商品名为Prevnar[BIOPHARMA：Biopharmaceutical Products in the U.S.Market]。意大利科学家Francesco针对流行性脑膜炎也采用了利用其病菌表面多糖交联CRM197制作疫苗，他们从CRM197的结构上分析了交联的可行性，其中CRM197带有39个Lysin氨基酸残基和16个Arg残基，能提供较多的交联用的游离氨基。从实验结果来看，虽然化学交联率较高，但都没有达到理论交联率，而且，不同的糖其交联率也存在差异，这说明交联率也与交联物相关，参见：弗朗西斯科.贝体，保罗.克斯坛替，麦克.弗莱该，克罗的奥.鲁奇拉滋.多糖—蛋白交联疫苗的水溶性、沉积性和动力学特点。(Francesco Berti，Paolo Costantino，Marco Fragai，y and Claudio Luchinatz。Water Accessibility，Aggregation，andMotional Features of Polysaccharide-Protein Conjugate Vaccines.BiophysicalJournal Volume86January20043-9)。