[发明专利]siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体

说明书

技术领域

本发明属生物医学领域，特别涉及siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体。

现有技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是涉及基因功能、基因治疗、药物靶分子筛选等领域的重要研究手段。其中，筛选具有生物活性的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)是RNAi技术应用的关键步骤。目前，商品化的RNAi筛选系统以lac为报告基因，与靶基因序列重组构建融合基因表达载体。

(1)目前有invitrogen公司开发的商品化的RNAi目标筛选系统-------BLOCK-IT RNAi目标筛选系统。该筛选系统工作原理为：从任一Gateway中间载体或Ultimate ORF克隆重组目的基因到pSCREEN-IT/lacZ-DEST Gateway载体，并使用RNAi抑制试剂进行共转染。表达基因将与lacZ融合。通过分析检测β-半乳糖苷酶的活性，将产生的结果与从qRT-PCR获得的结果进行比较。β-半乳糖苷酶水平是目的基因RNAi诱导降解量的指示剂，β-半乳糖苷酶的水平越低，介导RNAi试剂的效果就越好。该筛选系统的不足之处在于：需要的实验步骤与实验试剂过多，不能直接从细胞内检测到筛选效果，而需要单独的半乳糖苷酶量化试剂盒，步骤繁多，而且价格昂贵，不适于大面积推广

(2)Xiu-Min ZHOU，Ju-Sheng LIN，Yi SHI，et al. Establishment of aScreening System for Selection of siRNA Target Sites Directed againstHepatitis B V

发明内容

为了克服上述现有技术不足，本发明的目的就是提供siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，通过检测荧光强度可以非常方便快速地鉴定相应siRNA序列的沉默效果，从而筛选出最有效的siRNA序列。

本发明的技术方案是这样实现的：本发明包括该载体以pEGFP-C1载体为基础，在1336-1363改造SSe8387I和NotI两个内切酶位点，其载体大小为4695bp，载体命名为pEGFP-RNAi，序列如下：

1    TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG

61    CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT

121    GACGTCAATA ATGAGGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA

181    ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC

241    AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA

301    CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC

361    CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG

421    ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG

481    GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT

541    ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTGG TTTAGTGAAC CGTCAGATCC GCTAGCGCTA

601    CCGGTCGCCA CCATGGTGAG CAAGGGCGAG GAGCTGTTCA CCGGGGTGGT GCCCATCCTG

661    GTCGAGCTGG ACGGCGACGT AAACGGCCAC AAGTTCAGCG TGTCCGGCGA GGGCGAGGGC