[发明专利]一种检测山羊催乳素基因单核苷酸多态性的PCR－RFLP方法

权利要求书

1.一种检测山羊催乳素基因单核苷酸多态性的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法，其特征在于，以山羊基因组DNA或包含PRL基因的DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg⁺⁺、dNTPs存在的情况下，利用一对聚合酶链式反应引物，在PCR条件下进行扩增，然后利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，再通过电泳检测鉴定山羊催乳素基因单核苷酸多态性；

所述的聚合酶链式反应引物包括：

上游引物：5′-ATTCCTGGAGCCAAAGAG-3′；

下游引物：5′-TGTGGGCTTAGCAGTTGT-3′；

所述的限制性内切酶为Eco24I；所述的电泳检测是用琼脂糖凝胶电泳成像分析限制性内切酶Eco24I消化PCR扩增片段；

所述的单核苷酸多态性位点位于山羊催乳素基因第5外显子的X76049的第576位。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的条件是：25μL反应体系，包括1U Taq DNA聚合酶，10×Buffer 2.5μL，25mol/LMgCl₂ 1.5μL，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，100ng山羊基因组DNA或含催乳素基因序列的DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.25μL，灭菌超纯水15.0μL；

PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃ 30s，58.5℃ 30s，72℃ 30s共30～35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，限制性内切酶Eco24I的25-30μL酶切体系为：10-15μL的PCR扩增产物，2.5-3.0μL的含BSA的10×缓冲液，1.0-1.5μL的浓度10U/μL的Eco24I限制性内切酶，11.5-16.5μL的灭菌纯水；酶切消化条件：37℃恒温水浴摇床中消化5-8h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的电泳检测是用2.0-4.0％琼脂糖凝胶电泳成像系统分析限制性内切酶Eco24I消化PCR扩增片段，CC型表现为：170bp和26bp条带；CA型表现为：196bp、170bp和26bp条带；AA型表现为：196bp条带。