[发明专利]一种急性胰腺炎模型动物胰腺组织RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及胰腺的基因克隆、基因功能及转基因等分子生物学领域，更具体涉及一种急性胰腺炎模型动物胰腺组织RNA的提取方法，该方法亦适用于其它急性胰腺炎模型动物胰腺组织总RNA的提取。

背景技术

急性胰腺炎是一种并发症多、治疗棘手的临床常见重症，目前对其发病机制的探讨已深入到基因转录的水平。急性胰腺炎模型动物胰腺组织总RNA的提取，是进行cDNA文库构建、Northern杂交、RNA差异显示等实验的基本技术。相对于正常动物胰腺组织而言，急性胰腺炎模型动物胰腺组织的总RNA提取难度比较大，主要原因是急性胰腺炎发病时，体内胰酶被异常激活，引起胰腺组织自身消化，导致大量腺泡细胞坏死，RNA迅速降解，因而提取的总RNA不完整，不利于后续实验的顺利进行。

RNA在核浆部位转录产生，约20％进入胞浆，留在核内将近80％的RNA在1小时内被RNA酶降解。急性胰腺炎发病时，胰酶激活消化胰腺组织，导致腺泡细胞坏死，细胞核崩解，RNA酶大量释放，使RNA迅速降解。缺血、器械分离和修剪等因素均能增加腺泡细胞坏死的数量，加速RNA的降解过程。减少胰腺组织RNA降解的方法在于抑制胰酶的活性，最大限度的保持腺泡细胞存活数量。目前国内对于急性胰腺炎模型动物胰腺组织总RNA的提取技术未见报道，以急性胰腺炎胰腺组织总RNA为基础的分子生物学研究亦较难开展，造成该领域研究的局限。

在已报道的动物组织RNA提取方法中，基本上是把组织从动物体内直接取出，然后放入提取液中提取总RNA，或置于液氮中保存，留待后期提取。上述方法适用于正常动物胰腺组织RNA的提取，但对于急性胰腺炎模型动物胰腺组织RNA的提取效果较差。急性胰腺炎模型动物胰腺组织RNA的提取，需要专用方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从急性胰腺炎模型动物胰腺组织中提取总RNA的方法，该方法实验过程简便，操作方便、安全，实验结果准确、有效，对于急性胰腺炎模型动物的胰腺组织进行RNA层面的研究(如基因克隆、cDNA文库构建、蛋白质体外翻译等)，将会起到明显的促进作用。

实现上述发明目的的技术方案是：一种急性胰腺炎动物模型的胰腺组织总RNA提取方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)制备灌洗液，成份如下：HEPES 25mM，胶原酶IV 40U/ml，大豆胰蛋白酶抑制剂0.1mg/ml，NaCL 100mM，KCL 5mM，MgCL₂1mM，CaCL₂1mM，D-右旋糖14mM，谷氨酰胺2mM，2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)，用灭菌生理盐水配制，将所述的灌洗液滤膜除菌后于95％O2、5％CO₂、37℃孵育2小时以上备用；

2)麻醉急性胰腺炎模型动物，从十二指肠乳头处插管至主胰管，缓慢注入适量的灌洗液；

3)切下模型动物胰腺组织，在4℃预冷的大豆胰蛋白酶抑制剂(0.2mg/ml)中修剪、涮洗，置于4℃的TRIzol裂解液中匀浆；

4)按TRIzol裂解液试剂盒说明书的步骤，提取胰腺组织中的总RNA；并以分光光度法测定总RNA的浓度和OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，估算其纯度，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。

本方面的方法能够抑制胰酶的活性，最大限度的保持腺泡细胞存活数量。所配制的灌洗液，其离子浓度、营养成分、PH值等均适宜腺泡细胞的生存。切下的胰腺组织在高浓度的大豆胰蛋白酶抑制剂中修剪、涮洗，可进一步抑制胰酶的活性。使用上述方法对急性胰腺炎模型动物胰腺组织进行前处理，可以使提取出的总RNA纯度和完整性达到实验要求。

附图说明

图1、2、3分别为新鲜组织法、液氮冷冻法和本方法提取的急性胰腺炎大鼠胰腺组织总RNA的1％琼脂糖凝胶电泳图。每张图中，自左向右的泳道分别为急性坏死型胰腺炎、急性水肿型胰腺炎和正常组大鼠胰腺组织的总RNA。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，该实施例用于进一步解释本发明，本发明不限于该实施例。

具体实施方式

1.实验药品的配制和实验用品的处理

1)实验药品的配制