[发明专利]一种农杆菌介导转化柳枝稷的方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导转化柳枝稷的方法，其特征在于，该方法按如下步骤进行：

步骤一：人工诱导幼穗为外植体

在柳枝稷生长发育至有6个节时，人工切取最上处茎节，切取部位包含茎节上下区段长度各1～1.5cm，灭菌；以MBP培养基上人工诱导幼穗，其中MBP培养基为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、琼脂粉7.5g/L，PH＝5.8，28℃条件下光照培养至幼穗长度为1～1.5cm；

步骤二：诱导胚性愈伤组织

将人工诱导幼穗切成0.2mm，同一人工诱导幼穗的切块置于同一器皿中，24℃条件下以SMB培养基暗培养，诱导胚性愈伤组织，其中，SMB培养基的配方为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、2，4-二氯苯氧乙酸5mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.15mg/L、聚乙烯吡咯烷酮4.0g/L、琼脂粉7.0g/L，PH＝5.8；

步骤三：农杆菌转化和共培养

挑取农杆菌一单克隆于含有卡那霉素和利福平的50mL的LB或AB培养基中，在28℃条件下，以200rpm/分钟～250rpm/分钟培养1～2天，至农杆菌菌株浓度为OD₆₀₀＝0.8～1.0；

其中，LB培养基为：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，PH＝7.0；

AB培养基为：AB无机盐和磷酸盐溶液，葡萄糖5g/L，PH＝7.0；

在LB或AB培养基中加入50μl 100mM乙酰丁香酮继续培养1～2小时；

将培养基转入无菌的50mL离心管中，常温下，3500rpm/分钟，离心15分钟收集农杆菌，以液体M1培养基重新悬浮农杆菌，调节农杆菌菌株浓度为OD₆₀₀＝0.5；其中，液体M1培养基为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L PH＝5.8；

用镊子将愈伤组织夹成直径为1mm～2mm的块状，加入悬浮好的农杆菌菌液，同时加入40μl 100mM乙酰丁香酮，在真空台上抽真空10～15分钟后，常温下，以50rpm/分钟～60rpm/分钟培养20分钟～30分钟；

弃去全部农杆菌菌液，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面残留的菌液，然后将愈伤组织转入用筛选培养基SM1充分浸透过的无菌滤纸上，在20℃～24℃条件，暗培养2～3天；

步骤四：抗性愈伤组织的筛选

将愈伤组织转入筛选培养基SM1，24℃，暗培养2星期，然后转入筛选培养基SM2，24℃，暗培养4星期；

其中，筛选培养基SM1为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L、潮霉素75mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，PH＝5.8；

筛选培养基SM2为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L、潮霉素50mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，PH＝5.8；在此培养期间，若发现有农杆菌污染的愈伤组织，及时将同皿的其他正常愈伤组织转入新的筛选培养基筛选；

步骤五：抗性愈伤组织的分化

将经过筛选获得的抗性愈伤组织转入分化培养基SMK1，28℃，光照条件下培养2～3星期，然后转入分化培养基SMK2，28℃，光照条件下培养3～4星期；

其中，分化培养基SMK1为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、激动素0.2mg/L、潮霉素25mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；

分化培养基SMK2为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、激动素0.2mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；

步骤六：再生转化苗的生根培养

当再生苗生长1cm～2cm高时，转入生根培养基SMO中，28℃，光照条件下培养3～4星期至幼苗高度为5cm以上，其中，生根培养基SMO为：MS无机盐和维生素混合物2.22g/L、蔗糖8g/L、琼脂粉7.0g/L，pH＝5.8；

步骤七：移栽至温室进行分子生物学方法检测

再生植株移栽至温室中，在幼苗4～6叶期，取叶片进行PCR和GUS检测，根据前期检测结果，在植株生长至6～8叶期时，对PCR检测阳性植株进行Southern杂交，获得含有目标基因的转化植株；

步骤八：目的基因表达的转基因植株的获得

根据目的基因表达时期不同，对Southern杂交检测阳性植株在相关时期进行RT-PCR、Nouthern杂交和Western杂交检测，同时根据目标性状，筛选获得目的基因表达的转基因植株。