[发明专利]一种柳枝稷的体外繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物能源植物柳枝稷的生物技术领域，进一步涉及一种柳枝稷体外繁殖的方法。

背景技术

柳枝稷(英文名Switchgrass，拉丁名Panicum virgatum Linn)属于禾本科，黍属，是一种多年生的优良牧草，在我国已有悠久的栽培历史。近几年来，因其栽培技术简单，适应性广，防风固沙能力强，耐瘠薄，生物学产量高，可利用低质地或荒漠化土壤，被国际上确定为替代粮食资源以生产燃料乙醇的首选生物能源植物。目前，世界上以美国为代表的许多国家都投入了大量的人力、物力进行柳枝稷的研究开发。其中，采用生物技术增强柳枝稷的抗逆性，提高光合效率，增加生物学产量，降低木质素含量和提高乙醇产率等方面已成为目前的研究热点之一。

体外繁殖技术是生物技术的主要组成部分之一，在遗传转化体系的建立，优良种质规模的扩张(包括常规品种和转基因材料)和濒危物种的繁殖保存等方面都具有十分重要的意义。目前，在柳枝稷的体外繁殖方面，主要采用从人工诱导的愈伤组织中再生植株的传统方法。然而，与大多数禾本科植物的组织培养相似，柳枝稷在人工诱导愈伤组织方面也存在基因型差异，培养周期长，再生率低，成本较高等缺点，使生物技术在柳枝稷上的应用受到了一定限制。探索一种避开通过愈伤组织再生植株的体外繁殖方法，对柳枝稷的生物技术研究将起到很大的促进作用。

发明内容

针对上述现有柳枝稷体外繁殖技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种柳枝稷的体外繁殖方法，以拓宽柳枝稷组织培养和遗传转化的基因型范围，缩短培养周期，提高再生率，降低实验成本，加速转基因植株后代的繁殖，推进生物技术在柳枝稷上的广泛应用。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一种柳枝稷的体外繁殖方法，其特征在于，该方法按如下步骤进行：步骤一：选择适宜生长发育阶段的茎节组织

在柳枝稷生长发育至有5～6个节时，去除顶端和基部的2个茎节，人工切取中间3～4个茎节处的茎节组织，茎节组织包含切取茎节的上下区段各1～1.5cm长度。

步骤二：诱导初生再生芽

对茎节组织进行灭菌，以MBP培养基人工诱导初生再生芽，其中，MBP培养基为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L，麦芽糖30g/L，6-苄基氨基嘌呤3mg/L，琼脂粉7.5g/L，PH＝5.8，28℃条件下光照培养至再生芽长度为0.5cm～1.5cm。

步骤三：丛生芽块生长点的人工处理

沿再生芽基部2mm～3mm处切除再生芽，28℃条件下继续光照培养至再生芽长度为0.5cm～1.5cm时，再次切除再生芽，重复进行4～5次，至茎节组织处的丛生芽块直径为0.5cm左右。

步骤四：丛生芽的大量诱导

再以MBP培养基对丛生芽块进行人工诱导，28℃条件下，光照培养至丛生芽长度平均为2.0cm～2.5cm，再生出较大规模的丛生芽。

步骤五：丛生芽生根培养

沿丛生芽块基部切取并分离出每个丛生芽，转入生根培养基SMO中，28℃，光照条件下培养2～4星期至每个丛生芽幼苗高度约为5cm以上，得到再生植株；其中，生根培养基SMO为：MS无机盐和维生素混合物2.22g/L、蔗糖8g/L、琼脂粉7.0g/L，pH＝5.8。

步骤六：移栽至温室或大田

将再生植株炼苗3～5天后，移栽至温室或大田即可。

本发明与传统的通过人工诱导愈伤组织再生植株的柳枝稷体外繁殖方法相比，在组织培养和遗传转化的基因型选择，培养周期，再生频率及促进转基因植株后代的繁殖等方面都取得了较大的提高，效果显著。具体表现在：

1.拓宽了柳枝稷组织培养和遗传转化的基因型范围

与大多数禾本科植物的组织培养相似，柳枝稷在人工诱导愈伤组织方面也存在基因型差异。因为愈伤组织的分化能力在很大程度上是受基因型影响的，这使柳枝稷组培或转化材料的选用受到了很大限制，造成目前组培或转化都集中在个别基因型(目前主要选用的基因型为Alamo)，而这些基因型又并非生产实践所需要或在生产上应用很有限。育种上要利用导入的外源目的基因，目前还只能采用传统的常规育种方法如回交、杂交等方法将其转育到生产上推广的优良品种中，造成了人力、物力的浪费。本发明利用柳枝稷茎节生长点直接再生植株，不需要经过愈伤组织的分化阶段，实践证明可以利用生产上现有的所有基因型，极大地拓宽了柳枝稷组织培养和遗传转化的基因型范围，为利用生物技术对柳枝稷进行遗传改良奠定了良好的基础。