[发明专利]高效液相色谱法中分离磷脂的流动相

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效液相色谱法分离磷脂时使用的流动相，属于有机化学分析技术领域。

背景技术

用高效液相色谱法分离磷脂的方法包括等度洗脱法和梯度洗脱法。一般用高效液相色谱仪和紫外检测器联用(HPLC-UV)来检测磷脂，高效液相色谱仪给色谱柱提供流速稳定和压力较高的流动相，使样品在色谱柱进行分离，然后用紫外检测器来检测被分离的磷脂。如果检测时流动相各溶剂比例恒定，则是等度洗脱法，如果仪器按照需求自动混合不同的溶剂，则是梯度洗脱法。梯度洗脱法溶剂的配比随时间而变化，每次分离都需要重新平衡，所以分析时间长、操作复杂、工作量大；而等度洗脱法操作简单、省时、重现性好、不存在重新平衡的问题，所以被广泛使用。但是等度洗脱法的条件难以摸索，流动相各溶剂的配比较难确定。

另外，由于磷脂的最大吸收波长在205nm左右，而许多试剂在波长205nm左右也有强烈的吸收，容易干扰磷脂的检测，导致紫外检测器灵敏度降低。因此，等度洗脱法主要使用以下流动相：由乙腈-甲醇-磷酸/硫酸组成的流动相，和由正己烷(或三氯甲烷/二氯甲烷)-异丙醇-氨水组成的流动相，以及其它类似的流动相。其中，乙腈-甲醇-磷酸/硫酸组成的流动相中的磷酸/硫酸会产生沉淀，使高效液相色谱仪中高压泵的柱塞和密封垫摩擦产生划痕而造成系统漏液。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效液相色谱法中分离磷脂的流动相，解决现有技术等度洗脱法中高效液相色谱仪使用时流动相的配比和沉淀问题。

本发明所提出的高效液相色谱法中分离磷脂的流动相，其组成按体积百分比包括：甲醇10％～50％，乙腈50％～85％，氟代有机酸0.5％～3％，水0.5～3％。所述流动相组成的合适体积百分比为：甲醇10％～25％，乙腈75％～85％，氟代有机酸1％～2.5％，水1％～3％。所述流动相组成的较佳体积百分比为：甲醇19～20％，乙腈77～78％，氟代有机酸1～2％，水1.5～2.5％。所述氟代有机酸包括三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸的任一种。

本发明所提出流动相的作用原理：随着蒸发光散射检测器的发展，在205nm处有强烈吸收的一些试剂也可以进行应用，本发明结合高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)发现多种酸可以代替磷酸/硫酸等添加剂应用到磷脂的检测，而且与仪器的兼容性非常好，所以高效液相色谱仪对流动相的吸收波长已无要求，但是对高效液相色谱仪有腐蚀沉淀损害作用的含磷酸/硫酸的流动相仍被广泛使用。通过试验和分析，现有流动相中的磷酸/硫酸等无机添加剂在有机流动相中的溶解度有限，未溶解的磷酸/硫酸以沉淀形式存在于流动相，最终沉淀在泵系统中，造成柱塞杆和密封圈的摩擦损害。而由于三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸、九氟戊酸、十一氟己酸、十三氟庚酸、十五氟辛酸等氟代有机酸的结构类似、性质相近，用其替换磷酸/硫酸等无机酸，完全可以避免沉淀的产生，且不会对泵循环系统造成伤害，与仪器的兼容性非常好，可长期使用。为了减少有机酸对色谱柱造成损害，须在流动相中加入一定比例的水以提高流动相的pH值。

本发明所提出的流动相具有以下优点：

1、本发明流动相经长期使用，对高效液相色谱仪的泵系统未有任何损害。所述的氟代有机酸在任意比例的乙腈-甲醇-水中能以任意比例完全互溶，不产生任何沉淀，不会对泵系统造成损害，常年使用情况良好。

2、本发明的流动相可以在蒸发光散射检测器中用于检测被分离的磷脂，与紫外检测器相比，灵敏度高；而且从试剂应用角度讲，本发明流动相的应用基本不受任何限制。

3、使用本发明流动相检测得到的基线稳定，易于定量分析；而使用紫外检测器基线容易飘移，造成定量的不准确性。

4、本发明与梯度方法相比，使用单泵即可实现分离检测；而梯度方法需要多泵或者多元混合器才能实现。

5、本发明流动相采用合适配比时，除了可以对磷脂进行有效分离，还能分离出其他流动相无法分离的未知物质。

6、本发明流动相中加有一定比例的水，可提高流动相的pH值，减少有机酸对色谱柱造成的损害。

7、当本发明流动相应用于等度洗脱时，操作简单、省时、重现性好、容易重复。

附图及其说明

附图1是采用现有技术甲醇∶乙腈∶85％磷酸(64.7％∶34.9％∶0.4％)的流动相对红细胞膜样品中萃取的磷脂进行分离检测所得到的HPLC-UV色谱图；其能分离出四种主要磷脂(PS、PE、PC、SM)和一种未知物(*)，但长期使用会损害液相系统高压泵，导致泵漏液。