[发明专利]单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学免疫学，尤其涉及一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法。

背景技术

随着分子免疫学的发展，根据淋巴细胞膜表面分化抗原群(cluster ofdifferentiation，CD)的不同，可将T、B、NK淋巴细胞分成若干亚群，临床实验室通过抗分化抗原CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD56、CD16等的单克隆抗体(McAb)，对外周血淋巴细胞进行检测，依据其阳性率判定总T细胞、T辅助性细胞(TH)、T抑制/杀伤性细胞(T_S/T_c)亚群、B淋巴细胞、NK细胞等的分布和变化，从而判断人体的免疫功能，达到预防保健和疾病的诊断、治疗、预后(根据检测结果医生预计，估计某病的将来发展情况)的目的。

目前，常用的检测方法有流式细胞仪法、免疫荧光法、AP-AAP桥联酶免疫法和SPA(金黄色葡萄球菌A蛋白)花环法，其中SPA花环法分红细胞花环法和菌花环法，而红细胞花环法和菌花环法又分直接法和间接法。

SPA红细胞花环法的直接法因为应用单克隆抗体(McAb)而又叫单克隆抗体SPA红细胞花环法直接法，简称McAb-A-E直接法。该法在《全国临床检验操作规程》(中华人民共和国卫生部医政司编，第二版，东南大学出版社，1997：381-384和第一版1991：320-322)中有摘要性论述，但无详尽操作方法，实际工作中按“冻干抗体致敏红细胞花环试剂使用说明书”规定的方法进行具体操作：(1)在冻干抗体致敏红细胞花环试剂中加入pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液(简称无钙、镁Hank’S液)或磷酸盐缓冲液溶解；(2)按常规法用淋巴细胞分离液分离出外周血淋巴细胞(分离细胞以2000～2500rpm的转速离心20～30min；用无钙、镁Hank’S液洗涤2次，每次以1000～2000rpm的转速离心5～10min；)，最后用pH值为7.0～7.4的含20％新生小牛血清无钙、镁Hank’S液配成500万/mL；(3)将试管呈20度角斜放，于37℃孵育45min，将细胞悬液取出置另一试管中，离心去上清并恢复原量备用；(4)根据待检样品数取一定量致敏红细胞悬液，离心去上清，用含20％新生小牛血清的无钙、镁Hank’S液悬浮，恢复至原量；(5)淋巴细胞悬液与致敏红细胞悬液等量混合(各25μL)，室温(22～25℃)下放置10min，500rpm离心10min，室温下继续放置1小时，并在4℃放置2小时或过夜；(6)轻轻悬浮后加入25μL梅-格氏染液(May-Gruenwaid)室温染色10min后，离心去上清，再加50μL的姬姆萨染液(Glemsa液)染色30min(或单用Glemsa液染色)，当天或第二天看结果均可；(7)结果检查及判定：混匀后取一滴悬液于玻片上并加盖薄片，用高倍镜检查；淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者即除掉不计，共计数100～200个淋巴细胞，算出花环形成细胞的百分率。

虽然McAb-A-E直接法所采用的冻干抗体致敏红细胞花环试剂本身具有特异性强、敏感、稳定性好、有效期长、使用方便、仅需普通光学显微镜即可进行检测的特点，且实验结果可保存两周左右，十几年来被临床实验室和相关研究单位广泛应用，但是McAb-A-E直接法作为一种临床检测方法却由于存在检测步骤多、所需标本量相对较多、周期长、易造成被测细胞损伤和丢失、个别重要步骤无量化控制指标、非特异花环鉴别困难而影响计数结果等缺陷，无法适应临床上快速、准确的要求，使很多实验室，特别是临床实验室接受困难，限制了该方法的推广应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种检测过程简化、检测周期短、能够进行量化控制、满足临床检测要求的单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法，包括下述步骤：(1)在冻干抗体致敏红细胞花环试剂中加入0.5mL pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液，溶解成致敏红细胞保存液；