[发明专利]泛菌属菌Pantoea sp.M3及其用于降解孔雀石绿的方法

说明书

技术领域

本发明涉及泛菌属的新菌株，还涉及该菌株在降解孔雀石绿中的应用。

背景技术

孔雀石绿(malachite green，MG)作为杀真菌剂曾广泛应用于水产养殖业。MG进入生物体后，转化生成隐孔雀石绿(leucomalachite green，LMG)。MG及LMG在生物体组织中积累起来，不易代谢，具有致癌、致突变作用。加拿大欧盟等国均规定在食用水产品中禁止检出MG及其LMG。我国于2002年5月将MG列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。由于MG的代谢周期缓慢，一般鱼塘多年难以根本消除。因此，对渔业水域中MG的残留问题也应当加以高度重视。，

目前处理水中孔雀石绿的主要方法有物理方法，化学方法和生物方法。物理方法主要是通过吸附，沉降作用去除。化学方法主要有光助Fenton反应，异相光催化，光电催化，电化学方法等。但是这些处理方法投资大、流程复杂，物理吸附并未能将孔雀石绿分解去除，吸附后废水中仍有孔雀石绿残留，而且容易造成二次污染。

因此，人们采用微生物的方法降解MG。细菌降解孔雀石绿的报道很少。一项德国发明专利(Akad.Wiss.Microbial breakdown of ×enobiotic dyes oftriphenylmethane series[P].German patent：PN290004，PY1991.05.16.)筛选得到分枝杆菌Mycobacterium sp.和棒状杆菌属Corynebacterium sp，对于20mg/L孔雀石绿，在24℃可以在2h内使脱色率达到47％，在32℃，pH6.8，22小时内，完全脱色。Rajesh筛选得到一株库尔特氏杆菌能够降解孔雀石绿(Rajesh，1999)，该菌可在30min内完全使0.365～1.825mg/L的孔雀石绿完全脱色。Sun-YoungAn1等2002年发现一株柠檬酸杆菌属(Citrobacter)可完全脱色3.65mg/L的孔雀石绿。但是现有的微生物处理方法主要集中于MG的脱色研究，检测方法也多用紫外分光光度法，精确度不高，而且对其主要代谢产物LMG没有同时检测。代谢产物隐孔雀石绿同时降解后的检测的研究未见报道。

发明内容

1、要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种降解孔雀石绿高效、快速的细菌及其使用方法，利用该菌能够有效降解孔雀石绿。

2、技术方案

采用的技术方案如下：

一种泛菌属菌Pantoea sp.M3(CCTCC No.M 207022保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年3月12日)，其具有降解孔雀石绿的能力。

该菌种的主要特征为：菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性，兼性厌氧，过氧化氢酶、V.P.试验、MR试验、柠檬酸盐阳性，氧化酶、吲哚试验阴性，葡萄糖发酵产酸产气，不能水解淀粉。富集培养基上菌落呈白色圆形，边缘平滑，表面凸起，边缘整齐。在该培养基上30℃培养24h，菌落直径1mm～3mm.不能以孔雀石绿作为唯一碳源生长。

提取细菌总DNA，以细菌总DNA为模板，PCR扩增16S rDNA，扩增引物为细菌通用引物。正向引物为27f：5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’；反向引物为1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3’。PCR产物经电泳检验后委托上海博雅生物技术有限公司进行测序，将所得测序序列结果提交GeneBank，得到M3的16S rDNA序列的Genebank编号：EF192586。

本发明采用先富集后筛选的方法获得该菌株。其步骤如下：

1)从多次喷洒过孔雀石绿的鱼塘底泥中，取适量鱼塘底泥接种于含0.04mg/L MG的富集培养基中，30℃、150rpm黑暗培养。富集培养基的配方为(mg/L)：葡萄糖1000；NaCl 10；MgSO₄ 10；NH₄NO₃ 100；K₂HPO₄ 100；KH₂PO₄ 100；酵母膏60；pH7.0。

2)待培养液混浊且颜色转浅后，将悬浊液转接至下一批次新鲜培养液中(同步骤1中)，并逐步加大MG浓度，如此重复，直至MG浓度达5mg/L。

3)驯化后得到的混合培养物经富集培养基平板涂布分离和纯化，最终筛选得到MG高效降解菌株。