[发明专利]人源化改造的鼠ING4基因及其腺病毒表达载体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及人源化改造的鼠ING4(肿瘤生长抑制因子4)基因和经去GFP载体改造后的ING4重组腺病毒载体，含有该基因的重组载体和宿主细胞。本发明还涉及本发明的基因、重组载体和宿主细胞的制备方法和用途。

背景技术

肿瘤是当今社会影响人类健康的主要疾病之一。近代细胞生物学研究表明，体内细胞在增殖、分化和凋亡的过程中，受到体内正性和负性两类调控信号的调节。正性信号(癌基因、生长因子)与负性信号(肿瘤抑制基因、生长抑制因子)之间平衡的破坏会导致肿瘤的发生。肿瘤的发生发展受体内多种基因的调控。肿瘤抑制基因正是参与这一调控的重要分子，很多肿瘤中都有某些肿瘤抑制基因失活。向缺失某种抑癌基因的细胞内导入正常的抑癌基因，则可逆转肿瘤细胞的表型、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡，以达到治疗目的。

生长抑制基因家族(ING)成员，最早发现有ING1、ING2和ING3，其中ING1及ING2能以P53依赖的方式抑制细胞增殖，诱导细胞G1期阻滞及细胞凋亡(参见，如I.Garkavtsev等人，Nature 391(1998)295-298；C.C.Helbing等人，Cancer Res.57(1997)1255-1258；以及M.Nagashima等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)9671-9676)。ING3能增强P53下游基因表达，如P21及Bax等(参见M.Gunduz等人，Oncogene 21(2002)4462-4470)。

2004年又发现ING4(参见R.M.Hu，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)9543-9548)，ING4基因位于染色体12p13.31，至少有8个外显子。生物信息学分析显示ING4有一个PHD(plant homeodomain)锌指区和核定位信号(NLS)区。

ING4在多数肿瘤中有缺失突变，Mehmet Gunduz等根据ING4周围6个微卫星标志(D12S372，D12S77，D12S1697，D12S89，D12S825，D12S391)，发现在50例肿瘤样品中，66％肿瘤组织样品有D12S825标记的改变，它离ING4基因仅700bp(参见M Gunduz等人，Gene356(2005)109-117)。另外发现在一些细胞中有465位C，446位A单核苷酸的缺失，而导致了移码突变，并提前产生了终止密码，从而使表达的ING4缺失了一半的氨基酸，其中包括PHD锌指结构缺失(参见S Kim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)16251-16256)。有研究显示ING4稳定表达可使体外培养的肝癌细胞系(HepG2)G2/M期增加，同时细胞凋亡增加了20％，将过表达ING4的HepG2细胞接种到裸鼠体内，其生长速度明显减慢。此外，研究表明ING4还能增强了HepG2对化疗药物的敏感性，如阿霉素(DOX)和鬼臼乙叉甙(ETO)(参见Xin Zhang等人，FEBS Letters，570(2004)，7-12)。

Masaynki shi seki等发现ING4在体内能与p53结合，并能提高P53382位赖氨酸的乙酰化程度，进而提高P53下游基因如P21、BAX等的表达，但P53本身的表达无明显改变(参见Masayuki S等人，Cancer research，63(2003)，2373-2378)。zhang xin等人通过表达了一系列GST-ING4不同区域的融合蛋白，进行了GST结合实验(pull down)，进一步证实ING4的核定位信号在与p53结合中起关键作用(参见Xin Zhang等人，Biochemical andBiophysical Research Communications 331(2005)1032-1038)。