[发明专利]由玉米浆发酵－酶催化法合成7－氨基－3－脱乙酰氧基头孢烷酸

说明书

技术领域

本发明属于生物酶工程技术领域，涉及制备和提纯7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)的生物合成方法。

背景技术

头孢菌素类抗生素是β-内酰胺抗生素的重要一种。起初，是由产黄支顶孢(Acremonium chrysogenum)天然产生。近年来，主要通过人工合成法来获取。7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)是合成头孢菌素类抗生素的关键母核，通过人工合成方法来制取7-ADCA，再进一步合成头孢氨苄、头孢拉定、头孢克罗、头孢他美酯和头孢羟氨苄等多种头孢素类抗生素。7-ADCA的合成方法主要有化学合成法、半合成法和生物合成法。

目前，化学合成和半合成法仍是合成7-ADCA主要方法：EP0169144(1986)介绍，以青霉素G钾为原料，经过氧化、酰化、扩环、水解和裂解等反应过程而制得7-ADCA。CN1201795A介绍，以青霉素钾盐为原料，经氧化、硅酯化、环裂、分子重排、环合、水解和再裂解等反应合成7-ADCA。由于化学合成法的步骤复杂、反应条件要求高，特别是裂解等过程采用了较高的温度，使得产品质量差和成本高，也带来环保的问题，因此，人们又采用了化学与生物合成相结合的半合成法。将化学合成的裂解等反应过程改为酶催化法，这样可以使化学合成中的一些不利反应得到一定程度的改进。如张玉祥等，“7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的合成研究”(中国抗生素杂志，2000，25卷，178-180)；曲红梅等，“从青霉素G生产7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸”(中国医药工业杂志，2000，8卷)。

生物合成法是近年发展起来的制备7-ADCA的方法，又有两重方法。其一，是以青霉素G钾为原料，使用扩环酶和酰化酶催化法制取7-ADCA，如，CN1807581A介绍，产黄青霉菌及其在生产7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的应用。另一种是发酵法，以青霉素为原料，经过发酵法实现扩环，经酰基转移酶裂解等过程制备7-ADCA。如，CN1840687A介绍，将青霉素、水、发酵酶、营养液等，放在一起发酵，用有机溶剂萃取，再经裂解、脱色和结晶等过程制取7-ADCA。CN1840687A介绍，7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸的发酵直通生产方法，是以青霉素为原料，与水、发酵消泡剂、发酵酶、营养液一起发酵，再经萃取、裂解、脱色和结晶等过程而制取7-ADCA。各种方法几乎都是用青霉素G钾为原料，采用各种方法合成7-ADCA。

如今，化学法合成7-ADCA，已经逐步被淘汰。半合成法、生物合成法已经被普遍采用，特别是发酵法是被普遍看好的新方法。国内也已经引进了半合成法和生物合成法，还都是以青霉素G钾为原料，生产成本比较高，同时，关键的固定化酶等还主要依赖进口，而发酵法的工艺技术还没有达到工业化的水平。

在现代化生物工程领域中，膜分离技术的应用越来越受到关注，因为膜分离设备，可以很好地将大分子和小分子物质分离开，而且作为催化剂的大分子物质(酶分子)和细胞的活性损失较小，可以进行反复使用。膜分离技术还可以应用到酶催化反应后的废水处理，可以用很低的成本，达到很好的处理效果。膜分离技术操作简单，成本低，容易实现连续化操作。这为发酵法制备7-ADCA提供了强有力的援助，说明该技术的工业化应用时机已经成熟。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发酵-酶催化法合成7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸的方法：以玉米浆为原料，用带棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的扩环酶基因，对玉米浆进行菌株转化，使其在培养基中发酵，并在培养基中加入苯乙酸，玉米浆经扩环和与苯乙酸作用后，生成苯乙酰基-7-ADCA。用乙酸丁酯萃取发酵液，得到苯乙酰基-7-ADCA的萃取溶液。用水反萃取上述溶液，又得到苯乙酰基-7-ADCA的水溶液。在该水溶液中加入酰基转移酶和营养液构成酶反应培养基，在适宜的工艺条件下，苯乙酰基-7-ADCA经脱苯乙酰基侧链，而得到7-ADCA。

采用发酵-酶催化的生物合成法，包括种子培养基的培养、发酵培养基的培养、酶反应培养基的培养、有机溶剂萃取、水反萃取、酶催化脱酰基、萃取结晶和重结晶等过程。其中，种子培养基的培养过程，就是扩环菌的转录和发酵过程。

本发明通过下述方法实现的：

1、种子培养基的培养：将带棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的扩环酶基因，接种于种子培养基中，经调培养基的pH值，消毒后，放于旋转摇床，控制一定的温度、转速和培养时间，即可收获种子培养基。